广州管圆线虫半乳糖凝集素-1基因的克隆、表达和凝集反应
目的 克隆、表达广州管圆线虫(A ngiostrongylus cantonensis)半乳糖凝集素-1(galectin-1)基因并分析其凝集反应. 方法 用Swiss Model分析galectin-1的三维结构.提取广州管圆线虫雌性成虫总RNA,根据galectin-1基因编码序列(GenBank登录号为JN133961.1)设计引物,RT-PCR扩增目的基因,亚克隆至pColdⅢ质粒,转化大肠埃希菌(Escherichia coli) BL21,取重组质粒进行双酶切、PCR鉴定和测序.阳性质粒经0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍柱亲和层析法纯化galectin-1重组表达蛋白后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白表达情况.以广州管圆线虫全虫免疫的小鼠血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)验证目的蛋白.将重组蛋白10倍稀释为5.55×10-1～5.55×10-5 ng/μl,显微镜观察其与新鲜的ICR小鼠血液中红细胞的凝集反应. 结果 Swiss Model分析结果显示,galectin-1以非二聚体形式发挥作用.galectin-1基因RT-PCR扩增产物约为850 bp,与预期结果一致.经双酶切、PCR和测序结果显示,重组质粒pColdⅢ-galectin-1构建成功.SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约36 000的可溶性重组融合蛋白.Western blotting分析结果显示,galectin-1蛋白能被全虫免疫的小鼠血清识别.凝集反应结果显示,galectin-1蛋白与小鼠红细胞发生明显凝集反应的最低浓度为5.55×10-4 ng/μl. 结论 克隆的galectin-1基因能在pColdⅢ原核表达系统中呈可溶性表达,并与小鼠红细胞发生凝集反应.
广州管圆线虫、半乳糖凝集素-1、原核表达、凝集反应
35
R383.19(医学寄生虫学)
国家自然科学基金81471234;温州市社会公益计划项目Y20150118;浙江省社会公益计划项目No.2017C33067Supported by the National Natural Science Foundation of China81471234;the Social Welfare Project of WenzhouY20150118;the Social Welfare Project of Zhejiang Province2017C33067
2017-04-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共5页
48-52
