检测4种人体疟原虫多重PCR体系的建立和应用
目的 应用新建的多重PCR体系检测4种人体疟原虫. 方法 应用DNAman软件比较分析4种人体疟原虫的18S rDNA基因序列,采用Oligo 6.0软件,在其第5和第6保守区间的变异区设计4条下游引物序列,并以含4种疟原虫18S rDNA部分序列的质粒DNA为模板,检测多重PCR体系的特异性和敏感性.此外,将新建的多重PCR体系与NP-1993体系的第1轮属特异引物组合,形成新的巢式PCR扩增体系(M-Nest体系),并用该体系和新建的多重PCR体系对不同稀释倍数的恶性疟和间日疟患者血样DNA进行扩增,检测这两种体系的敏感性.应用M-Nest体系和NP-1993体系检测广西2013年自加纳疟疾高流行区返乡人员的307份血样,比较两者的检测结果是否一致.最后,应用M-Nest和NP-2002体系对广西2014年1～5月份报告的66份镜检以卵形疟原虫感染为主的血样进行复核,比较两者的检测结果是否一致. 结果 应用新建的多重PCR体系得到的恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫的扩增片段大小分别为268、446、394和323 bp,且不同原虫的扩增条带恰好位于50 bp DNA标志物条带之间,更易于区分,但不同疟原虫的Tm值较为接近,不易区分和鉴别虫种.新建体系对4种疟原虫18S rDNA基因的最低检出浓度分别为:恶性疟原虫5.58×102拷贝/μl,三日疟原虫1.56×103拷贝/μl,卵形疟原虫1.66×103拷贝/μl,间日疟原虫1.80×102拷贝/μl.新建体系对恶性疟原虫血样的最低检测浓度为1.43×102～8.84×103拷贝/μl或5.10×10～4.92×102个原虫/μl,高于间日疟原虫的17.4～69.1拷贝/μl和13.5～83.2个原虫/μl.与单独的多重PCR体系相比,应用M-Nest检测体系将对疟原虫的最低检测浓度降低了10～100倍.M-Nest体系和NP-1993体系对从加纳返乡的307份血样的检测结果不一致,并且M-Nest体系还检测到2例卵形疟原虫感染,而NP-1993体系则未能检测到该感染.此外,M-Nest体系和NP-2002体系对66份镜检以卵形疟原虫感染为主的血样的复核结果一致. 结论 新建的多重PCR检测体系可同时检测4种人体疟原虫,具有良好的现场适用性.
多重PCR、巢式PCR、卵形疟原虫wallikeri亚种
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R531.3(寄生虫病)
国家质检总局公益性行业科研专项No.201210056Supported by the Special Fund for Scientific Research in the Public Interest from General Administration of Quanlity Supervision,Inspection and Quarantine of China No.201210056
2015-07-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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