刚地弓形虫自噬相关蛋白8(TgAtg8)多克隆抗体制备及初步应用
目的 制备、评价特异性抗刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)自噬相关蛋白8(autophagy protein 8,TgAtg8)多克隆抗体. 方法 生物信息学方法分析弓形虫基因组中自噬相关蛋白的基因序列和氨基酸序列.以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增TgAtg8编码基因,克隆入pGEX-6p-1载体,构建pGEX-6p-1-TgAtg8 重组质粒,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况.谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签亲和层析法纯化表达产物.以纯化的TgAtg8蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,获得特异性抗TgAtg8多克隆抗体.以制备的多克隆抗体作为一抗,进行Western blotting分析和间接免疫荧光(IFA)检测. 结果 双酶切和测序结果证实,原核表达质粒pGEX-6p-1-TgAtg8构建成功.SDS-PAGE和Western blotting结果表明,TgAtg8蛋白在E.coli BL21中获得高效表达,其融合蛋白相对分子质量(Mr)约40 000,与理论值相近.Western blotting结果证实,所制备的多克隆抗体能特异性识别融合蛋白TgAtg8和虫株体内天然的TgAtg8蛋白.IFA实验表明,TgAtg8均匀分布于虫体胞浆中,但在自噬诱导培养后,TgAtg8逐渐聚集成颗粒状. 结论 制备的特异性抗TgAtg8多克隆抗体可用于检测虫体内TgAtg8蛋白在弓形虫自噬形成过程中的变化情况.
刚地弓形虫、自噬相关蛋白8、细胞自噬、多克隆抗体
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R382.5(医学寄生虫学)
浙江省自然科学基金资助项目No.LY12H19004Supported by the Natural Science Fund of Zhejiang Province LY12H19004
2014-05-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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