华支睾吸虫成虫转录辅激活因子基因在原核细胞中的克隆、表达及其生物功能分析

摘要：

目的构建华支睾吸虫成虫转录辅激活因子(transcriptional coactivator, TC)基因(TC基因)原核重组质粒, 进行原核表达、鉴定及生物功能分析. 方法根据TC基因已知序列设计1 对引物, 从华支睾吸虫成虫 cDNA 文库中扩增TC基因片段;将目的基因进行聚合酶链反应(PCR), 其产物和空质粒pGEX-4T-1、pET30a(+)同时用限制性内切酶 BamHⅠ、 SalⅠ双酶切, 纯化回收后连接并转化大肠埃希菌( E.coli BL21).将构建的重组质粒pGEX-4T-1-TC和pET30a(+)-TC分别经双酶切、PCR及测序鉴定后在大肠埃希菌BL21中诱导表达.用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果, 用亲和层析法纯化重组质粒pET30a(+)-TC表达产生的组氨酸重组蛋白(His-TC). 结果构建了TC基因原核重组质粒pGEX-4T-1-TC和pET30a(+)-TC.SDS-PAGE 结果表明TC基因在大肠埃希菌BL21 系统获得高效表达, 其重组蛋白分子量与理论值相符. Western blotting 结果表明重组质粒pGEX-4T-1-TC表达的谷胱甘肽硫转移酶(GST)重组蛋白(GST-TC)可被华支睾吸虫免疫兔血清识别, 具有免疫反应性. 纯化的TC基因的组氨酸(His)重组蛋白(His-TC)经SDS-PAGE显示单一条带. 结论通过生物信息学方法由华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出TC基因, 并成功予以克隆、表达及纯化.

关键词：华支睾吸虫、转录辅激活因子基因、基因重组、基因克隆、原核表达

所属期刊栏目：23

分类号：R383.22;R392.11(医学寄生虫学)

资助基金：广东省自然科学基金20003026;国家"211"工程建设项目98169;高等学校博士学科点专项科研项目博教No 93-186

在线出版日期：2005-07-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：18-23