家蝇GAPDH基因的克隆、表达及作为内参的可靠性分析

摘要：

目的 探讨家蝇甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因在不同饲料饲养、不同发育期及不同组织的转录和表达情况,评价其作为家蝇功能基因研究内参的稳定性. 方法 运用PCR技术扩增GAPDH基因完整编码序列,生物信息学方法预测该基因及其编码蛋白功能.构建pET-28a(+)-GAPDH重组质粒,转化到大肠埃希菌Transetta (DE3)中进行诱导表达,纯化重组蛋白制备多克隆抗体.运用Real-time PCR和Western blot检测家蝇不同发育期、三龄幼虫不同组织和不同饲养物处理下GAPDH基因的表达情况. 结果 家蝇GAPDH基因ORF全长999 bp,编码332个氨基酸,理论分子质量37.3 ku,等电点为8.57,具有GAPDH家族的蛋白保守结构域;构建的重组质粒经PCR及测序鉴定正确;SDS-PAGE分析显示重组质粒在Transetta (DE3)中表达,纯化后的表达产物与目的蛋白大小相符,Western blot显示该蛋白可被相应血清识别;Real-time PCR分析GAPDH基因在不同饲料饲养3龄幼虫、不同发育期均保持较好的转录稳定性,同时,Western blot分析GAPDH分子在家蝇不同发育期及3龄幼虫不同组织中均有表达,且表达量无明显差别. 结论 GAPDH基因在不同发育期、不同组织及不同饲养物饲养的家蝇表达稳定,可作为家蝇可靠性内参基因使用.

关键词：家蝇、GAPDH基因、克隆表达、内参基因

所属期刊栏目：11

分类号：R384.2(医学寄生虫学)

资助基金：国家科技支撑计划;国家自然科学基金;贵州省高等学校创新能力提升计划;贵阳医学院院基金

在线出版日期：2016-06-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：250-256