PcDNA3.1(+)/CYP11B2真核表达质粒的构建及其在NCI-H295R细胞中的表达

摘要：

目的 构建人醛固酮合成酶基因(CYP11B2)的真核表达质粒,并在人肾上腺上皮细胞(NCI-H295R)中表达,为下一步定点突变研究奠定基础.方法 从人的肾上腺组织中提取总的RNA,采用RT-PCR扩增法扩增人的CYP11B2全长cDNA并克隆到PMD18-T载体中,然后再亚克隆于PcDNA3.1(+)真核表达载体,通过菌液PCR和酶切鉴定重组真核表达质粒,并以DNA测序证实.利用阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染NCI-H295R,RT-PCR和放射免疫法(RIA)检测CYP11B2基因的表达.结果 菌液PCR扩增和酶切证实真核表达质粒构建成功,测序表明CYP11B2基因cDNA全长(1509bp)和GenBank上公布的序列(D13752)相比较,存在一个碱基差异A3323G,这个变异使得第173位的赖氨酸变为精氨酸,核苷酸序列的同源性为99.9％,氨基酸序列的同源性为99.8％.真核表达质粒转染人肾上腺上皮细胞后CYP11B2 mRNA表达增加,细胞上清中的醛固酮含量显著增加.结论 ①通过查阅国外SNP数据库得知K173R为一个SNP位点,编号为rs4539.②成功构建了人CYP11B2基因的真核表达质粒,阳离子脂质体是NCI-H295R有效的体外转染体系,本实验为进一步研究该基因的结构与功能关系奠定了基础.

关键词：PcDNA3.1(+)/CYP11B2、NCI-H295R、转染

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在线出版日期：2019-10-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

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