原代滑膜细胞培养及同时提取微量总RNA和蛋白质的方法在体外细胞分子生物学研究中的应用

摘要：

目的:建立从少量原代培养滑膜细胞中同时提取微量总RNA和总蛋白质的方法.方法:向5×105原代成纤维样滑膜细胞(FLS)中加入0.3 ml的TRIzolTM试剂经过改良抽提总RNA;同时将抽提总RNA剩下的中下两相,用异丙醇-盐酸胍-无水乙醇抽提蛋白质.另外将FLS细胞标本分别采用经典的异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法(AGPC)和分子克隆实验手册介绍的十二烷基硫酸钠(SDS)-裂解法抽提总RNA和蛋白质作为对照.检测所提总RNA和蛋白质的纯度、完整性和生物学行为功能.结果:AGPC和TRIzolTM试剂提取的总RNA的18 S带和28 S带清晰可见,且28 S带比18 S带亮度强2～3倍,带与带之间无拖尾现象,A260/A280值均在1.8以上,含量18.5μg以上.检测两种方法所提总RNA的IL-1β和TNF-αmRNA表达,显示丰度高且两种方法的差异不明显.用总RNA抽提剩下的中下两相提取的蛋白质,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,蛋白质分离效果好,无杂质和蛋白降解,A280/A260值均在1.8以上,含量80μg以上.免疫印迹法对白介素-1β和肿瘤坏死因子-α蛋白质分析,均可见一条清晰的特异带,与常规SDS裂解液提取的蛋白质结果相同.结论:本研究建立了从FLS原代细胞中同时提取微量总RNA和总蛋白质的方法,得率高,纯度好,具有化学完整性和生物反应能力.

关键词：微量、原代培养、成纤维样滑膜细胞、提取、RNA、蛋白质

所属期刊栏目：15

分类号：R34(人体生物化学、分子生物学)

资助基金：国家自然科学基金81701915

在线出版日期：2022-05-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：276-282