芒柄花素抑制RANKL诱导破骨细胞分化的实验研究

摘要：

目的:建立RANKL诱导的破骨细胞体外研究模型,阐述活血化瘀中药鸡血藤有效组分芒柄花素(for-mononetin,FO)调控小鼠骨髓单核-巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化和功能的影响,探讨其抑制破骨细胞分化的分子机制.方法:取20只4～6周龄清洁级C57/BL6小鼠,雌雄各10只,体重(20±2)g,无菌条件下分离出股骨和胫骨内BMMs,用α-MEM培养基进行体外培养和增殖.BMMs在加入M-CSF和不同浓度的芒柄花素(5～50 μM)分别培养4 d后进行细胞增殖与毒性的CCK8检测.将生长状态良好的BMMs依次加入M-CSF和RANKL诱导破骨细胞分化,对照组无特殊处理,DMSO对照组加入DMSO溶剂,各观察组分别加入不同浓度芒柄花素(1～20 μM),分别进行培养6 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,对破骨细胞的进行计数和统计分析.分别在破骨细胞培养的1、2 d收取总蛋白和磷酸化蛋白,Western blot检测破骨细胞分化中关键转录因子NFATc1和c-Fos的表达以及磷酸化蛋白ERK表达;在培养的4 d提取RNA,Real-Time PCR检测破骨细胞相关基因CTSK、TRAP、MMP9和Car2的活性.结果:CCK8检测结果提示芒柄花素能够剂量依赖性地抑制BMMs的活性,在≤20 μM的安全浓度范围内对BMMs细胞生长无明显毒性效应(P=0.278＞0.05).TRAP染色结果发现芒柄花素在(1～20 μM)浓度范围内能够剂量依赖性的抑制破骨细胞的生成,尤其是10 μM能够显著抑制破骨细胞的生成(P=0.000＜0.05).Western blot检测表明芒柄花素(10 μM)能显著抑制破骨细胞分化关键蛋白NFATc1和c-Fos的表达,而对磷酸化蛋白ERK的表达未见明显的作用.在破骨细胞功能上,Real-Time PCR检测芒柄花素(10 μM)能著抑制破骨细胞功能相关基因CTSK(P=0.000＜0.05)、TRAP(P=0.000＜0.05)、MMP9(P=0.000＜0.05)和Car2(P=0.000＜0.05)的表达.结论:鸡血藤有效组分芒柄花素能够抑制原代骨髓单核-巨噬细胞向破骨细胞增殖和分化,并下调破骨细胞骨吸收功能相关蛋白和基因的表达,可能是其防治股骨头坏死中骨破坏及塌陷的机制之一.

关键词：芒柄花素、骨髓-单核巨噬细胞、破骨细胞生成、抗酒石酸酸性磷酸酶

所属期刊栏目：33

分类号：R-332(医学研究方法)

资助基金：江苏省青年医学重点人才项目;元锡市青年医学重点人才项目;苏州市中医医院博士青年课题

在线出版日期：2020-03-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：64-70