结核分枝杆菌新型抗原Rv3400的免疫原性研究

摘要：

目的 用结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)特异性抗原Rv3400联合弗氏不完全佐剂(incomplete Freund's adjuvant,IFA)构建结核亚单位疫苗(Rv3400-IFA),在C57BL/6小鼠体内评估其免疫效应.体外用抗原Rv3400感染巨噬细胞RAW264.7并评估其免疫应答.方法 PCR扩增基因Rv3400,构建重组质粒pET28a(+)-Rv3400,转入大肠埃希菌BL21 (DE3) pLysS感受态细胞中,诱导表达并纯化Rv3400蛋白.用抗原Rv3400、阳性对照脂多糖(lipopolysaccharides,LPS),分别刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,阴性对照为未刺激的巨噬细胞,流式细胞术检测细胞表面分子表达,收集细胞培养上清,ELISA检测细胞因子的分泌.另一方面纯化的Rv3400蛋白与IFA充分乳化构建亚单位疫苗免疫小鼠;C57BL/6小鼠采用数字表法随机分为3组,分别为实验组Rv3400组、阳性对照组Rv3425组、阴性对照组IFA组,每组5只,每2周1次、共免疫3次.分别采用酶联免疫斑点检测技术(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)和酶联免疫吸附测定(ELISA)技术对免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫进行评估.结果 (1)成功克隆表达并纯化结核分枝杆菌特异性抗原Rv3400.(2)体外细胞实验结果显示:Rv3400抗原刺激巨噬细胞,其表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ表达量显著提高,阳性细胞比率[分别由未刺激的(34.70±2.40)％、(31.25±18.31)％、(41.80±6.01)％、(44.30±0.44)％提高至1 μg/ml Rv3400抗原刺激后的(90.45±7.71)％、(90.10±4.10)％、(89.97±7.79)％、(85.13±5.12)％];能促进细胞分泌高水平的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6),分别达(49 217.0±390.61) pg/ml、(1783.4±51.18) pg/ml.(3)免疫小鼠后,ELISPOT结果显示:实验组Rv3400组小鼠分泌INF-γ的斑点形成细胞(spot forming cells,SFC)(136.20±95.09)显著高于阴性对照组(14.00±9.62)(t=2.859,P＜0.01);ELISA结果显示:Rv3400组小鼠T细胞产生TNF-α和IFN-γ的水平[(247.38±142.268)pg/ml、(325.45±75.19)pg/ml)]明显高于阴性对照组[(69.25±60.06) pg/ml、(2.22±1.28) pg/ml(t=2.579,P＜0.05;t=8.597,P＜0.01)];(4)Rv3400组小鼠脾CD4+ CD44high、CD4+ CD62Llow、CD8+ CD44high、CD8+ CD62LlowT淋巴细胞百分比[(44.20±11.95)％,(43.56±11.90)％,(48.88±7.42)％,(47.04±7.72)％]与对照组IFA组[(27.02±6.56)％,(62.60±4.73)％,(30.57±6.00)％,(58.48±6.06)％]相比,差异有统计学意义(one-way ANOVA,F=18.460,F=8.108,F=32.194;F=4.080;P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05),呈显著性增加.(5)通过间接ELISA测定免疫后的小鼠血清抗体IgG效价水平高达1:409 600,表明抗原Rv3400也能诱导有效的体液免疫应答;IgG2b/IgG1水平为1.8,说明抗原Rv3400诱导小鼠以Th1型免疫反应为主.结论 亚单位疫苗Rv3400-IFA在C57BL/6小鼠体内可产生较好的细胞免疫和体液免疫效应.结核分枝杆菌特异性抗原Rv3400有望成为新的结核病疫苗设计及诊断的候选抗原.

关键词：分枝杆菌、结核、Rv3400、亚单位疫苗、细胞免疫、体液免疫

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分类号：R39;R73

资助基金："十二五"国家科技重大专项2012ZX10003008

在线出版日期：2016-06-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：201-208