微滴式数字PCR定量检测鸡毒支原体方法的建立

摘要：

为建立微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)方法,以MG的mgpc基因序列为目的序列,在其保守区域内设计合成了1对特异性引物和1条探针,通过各反应条件优化,建立了检测MG的ddPCR方法,并测定了建立方法的特异性、敏感性以及重复性.结果显示:建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,探针浓度为10μmol/μL,退火温度为55℃;该方法只检出MG,没有检出鸡滑液囊支原体、禽衣阿华支原体、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽偏肺炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌,且相互间没有交叉反应;本方法最低检测MG重组质粒标准品的检测限为3.9拷贝/μL.重组质粒标准品浓度在3.9～41025拷贝/μL范围内,绘制的ddPCR绝对定量曲线与测得值呈良好的线性关系(R2=0.999);3次重复检测试验结果的变异系数均小于5％.对采集的60份病鸡喉拭子、气囊拭子及肺样品进行MG检测,结果ddPCR方法的阳性检出率(15.0％)高于荧光定量PCR方法(13.3％).结果表明,本研究建立的ddPCR方法定量检测MG特异性强,灵敏度高,重复性好,为绝对定量检测MG提供了技术手段.

关键词：微滴式数字PCR、鸡毒支原体、定量检测

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分类号：S855.3(动物医学（兽医学）)

资助基金：广西重点研发计划项目;中央引导地方专项;广西创新驱动专项;国家高层次人才特殊支持计划（国家“万人计划”）;广西八桂学者专项

在线出版日期：2022-09-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：121-127