布鲁菌Omp31的单克隆抗体在流式细胞术中的初步应用

摘要：

目的:利用布鲁菌Omp31的单克隆抗体，初步建立布鲁菌抗原流式细胞术（FCM）检测方法，分析该方法在人布鲁菌病（简称布病）临床样本检测中的价值。方法:牛种布鲁菌2308、104M、S19，羊种布鲁菌M5-90和猪种布鲁菌S2共5个菌株，经超声破碎，获得其菌液上清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和蛋白免疫印迹法（Western blot），检测已制备的抗布鲁菌Omp31单克隆抗体5H3对上述5个菌株的识别能力。构建Omp31重组真核表达载体（pcDNA3.1-Omp31）并转染人胚肾细胞（293FT细胞），Western blot检测Omp31蛋白的表达。羊种布鲁菌弱毒疫苗株M5-90侵染人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1细胞），构建含菌单核吞噬细胞。将5H3抗体用异硫氰酸荧光素（FITC）或藻红蛋白（PE）标记，采用FCM，利用FITC-5H3抗体检测pcDNA3.1-Omp31转染293FT细胞和含菌单核吞噬细胞，鉴定该抗体对细胞内布鲁菌抗原的识别能力，初步建立FCM的检测方法，并测定FITC-5H3抗体在FCM中的灵敏度。利用双抗体（PE-5H3和FITC-CD14）的流式细胞染色测定人外周血单个核细胞（PBMCs），分析该方法应用于人布病临床检测的可行性。结果:抗布鲁菌Omp31单克隆抗体5H3不仅能识别羊种布鲁菌M5-90菌株和猪种布鲁菌S2菌株，还能识别缺失Omp31基因的牛种布鲁菌2308、104M、S19菌株。FITC-5H3抗体可用于流式细胞染色识别细胞内的布鲁菌抗原，表达Omp31的293FT阳性细胞比例约为59.3%，疫苗株M5-90侵染的THP-1阳性细胞比例约为6.2%，检测293FT阳性转染细胞的灵敏度为4%。初步建立了基于PE-5H3和FITC-CD14的双抗体染色的FCM检测方法，该方法检测布病患者PBMCs中的双抗体阳性细胞比例（1.93%）高于健康人群（< 0.30%，阴性）。结论:利用FCM，初步建立了荧光素标记抗布鲁菌Omp31单克隆抗体5H3检测细胞内布鲁菌抗原的方法，并发现5H3抗体能识别牛种布鲁菌，弥补了布鲁菌抗原检测中Omp31的应用缺陷。此方法的建立为布病病原学检测方法的研究提供了新策略，为检测试剂的开发提供了新材料。

关键词：布鲁杆菌属、Omp31、单克隆抗体、流式细胞术、病原学检测

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资助基金：国家重点研发计划2017YFD0500300;校科研启动计划CX2017N007;National Key Research and Development Program of China2017YFD0500300;Research Initiative Project of SMUCX2017N007

在线出版日期：2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：647-653