HIF-1α特异性RNA干扰表达载体的构建及体外效应研究
目的 己知缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在缺氧状态下可通过调节内皮素-1(ET-1)的升高而参与肺血管内皮细胞损伤及肺动脉高压,最终导致肺出血.RNA干扰(RNAi)是双链RNA介导的序列特异性转录后同源靶基因沉默效应,目前RNAi技术已成为一种研究基因功能的有力工具,故拟通过构建人HIF-1α基因的特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,观测该载体在缺氧状态下对HIF-1α基因的干扰作用及对ET-1的抑制作用.方法 选择6个(a-f)可能的人HIF-1α siRNA干扰位点,设计合成相应的特异性互补寡聚核苷酸链(A～F),采用基因克隆技术,将合成的(A～F)链序列定向插入真核表达载体中,构建成重组质粒HIF-1α siRNA真核表达载体(A'～F'),通过脂质体法转染至体外人脐静脉内皮细胞(HUVECs)48 h,再以CoCl2(100μM)模拟缺氧刺激3 h后,观测siRNA对HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白表达的抑制效应及ET-1水平.结果 ①成功构建了分别针对6个HIF-1αsiRNA干扰位点(a～f)的重组质粒HIF-1α siRNA真核表达载体(A'-F');②该6组真核表达载体转染HUVECs并经CoCl2模拟缺氧刺激后,与未转染组比较,结果 显示B'及D'组明显抑制HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白的表达,并部分抑制ET-1表达,而其余4组与未转染组比较并无差异.结论 针对b及d干扰位点的B'及D'特异性siRNA真核表达载体,能明显干扰HIF-1α基因的表达,进而抑制ET-1的释放.该实验为下一步用B'、D'特异性siRNA真核表达载体在动物体内研究HIF-1α与新生儿缺氧性肺出血关系奠定基础.
RNA 干扰、小干扰 RNA、表达载体、缺氧诱导因子-1、内皮素-1
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R-33(医学研究方法)
2008-05-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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