稳定低表达GSNOR细胞系Neuro-2a的构建及其对S-亚硝基化的影响

摘要：

目的:探讨转染慢病毒载体构建稳定低表达S-亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reduc-tase,GSNOR)的小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a细胞系,并考察稳定低表达GSNOR对S-亚硝基化修饰水平的影响.方法:构建靶向GSNOR的慢病毒载体,用LipoFiter?脂质体转染Neuro-2a细胞,并用嘌呤霉素筛选稳定低表达GSNOR的细胞系.光镜观察Neuro-2a细胞的形态变化,CCK-8法检测转染不同时间后的细胞活力,RT-qPCR和Western blot检测GSNOR的mRNA和蛋白表达水平.生物素转换法检测转染后Neuro-2a细胞内总S-亚硝基化蛋白水平.结果:HBLV-m-ADH5-shRNA1-PURO慢病毒载体序列与目的序列结果一致,提示慢病毒载体构建成功.嘌呤霉素筛选后,光镜观察Neuro-2a细胞形态良好,CCK-8实验结果显示在24、48、72和96 h时点细胞活力无显著差异,提示转染对细胞活力无明显影响.转染第2、4和6代后细胞内GSNOR mRNA水平分别是空载病毒组的37.02％、40.66％和30.13％,均显著降低(P<0.01),GSNOR蛋白表达水平较空载病毒组亦显著下降(P<0.01).此外,稳定低表达GSNOR的Neuro-2a细胞中蛋白S-亚硝基化修饰水平显著上调(P<0.01).结论:稳定低表达GSNOR的Neu-ro-2a细胞系构建成功,GSNOR低表达可上调胞内总蛋白的S-亚硝基化修饰水平.

关键词：S-亚硝基谷胱甘肽还原酶、慢病毒、Neuro-2a细胞、S-亚硝基化

所属期刊栏目：38

分类号：R741.02;R363.2(神经病学与精神病学)

资助基金：国家自然科学基金;浙江省自然科学基金资助项目;浙江省医药卫生科技项目;浙江省医药卫生科技项目

在线出版日期：2022-10-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：1547-1552