miRNA let-7a1真核表达载体的构建及对肺癌细胞增殖的影响

摘要：

目的:构建miRNA let-7a1真核表达载体,研究其在肺癌A549细胞株的表达及对A549细胞增殖的影响.方法:以人肺癌细胞A549的总RNA为模板,RT-PCR扩增miRNA pre-let-7a1基因序列, 将miRNA pre-let-7a1基因克隆到真核表达载体pSilencerTM4.1-CMV neo中,构建成pSilencerTM 4.1-let-7a1重组体.将pSilencerTM 4.1-let-7a1表达载体瞬时转染肺癌A549细胞,RT-PCR法检测miRNA let-7a1在转录水平的表达.根据miRBase Targets数据库,查hsa-let-7a1靶序列,构建 let-7a1靶序列-报道基因融合质粒pMIR-report-let-7a1T,与pSilencerTM 4.1-let-7a1表达载体共转染A549细胞,通过荧光素酶活性检测pSilencerTM 4.1-let-7a1质粒对其靶序列的作用.MTT法检测pSilencerTM 4.1-let-7a1转染A549细胞后,对细胞增殖的影响.结果:pSilencerTM 4.1-let-7a1真核表达栽体和let-7a1靶序列-报道基因融合质粒经酶切及测序鉴定正确.pSilencerTM 4.1-let-7a1转染 A549细胞后,经RT-PCR证明能有效表达miRNA let-7a1. pSilencerTM 4.1-let-7a1 质粒和pMIR-report-let-7a1T质粒共转染A549细胞后,通过报告基因检测,相对荧光素酶活性明显降低,表明pSilencerTM 4.1-let-7a1转染A549细胞后,可表达let-7a1并具有生物学活性.MTT检测结果显示:pSilencerTM 4.1-let-7a1 转染后的A549活细胞数目明显减少.结论:成功构建了真核表达载体pSilencerTM 4.1-let-7a1,转染肺腺癌A549细胞后能有效表达,miRNA let-7a1基因过表达抑制A549细胞的增殖.

关键词：miRNA、let-7a1、真核表达载体、A549细胞、细胞增殖、基因表达

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分类号：Q7(分子生物学)

资助基金：山东省自然科学基金资助项目Y2007C96;山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助项目20068503066

在线出版日期：2009-11-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：1495-1500