微量酶联夹心杂交法定量检测TNF-αmRNA

摘要：

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微板酶联夹心杂交技术,对人单核细胞分泌的TNF-α mRNA 进行定量检测.方法: 设计两条特异探针,其中一条为捕获探针,5'端带有氨基修饰,可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合,而且是"竖直"地包被在微孔内,另一个为检测探针,3'端带有生物素标记.提取人单个核细胞总RNA, RT-PCR后的扩增产物经变性后加入已包被好捕获探针的微孔板中,加入检测探针与已杂交的产物结合,最后加入亲和素-辣根过氧化物酶(avidin-HRP)显色系统催化底物显色,450 nm波长下检测吸光度进行定量.结果: 该方法检测TNF-α mRNA 的灵敏度,明显高于琼脂糖凝胶电泳,而且具有良好的重复性,等量PCR产物作10个复孔,吸光度的CV值为7.2%,批间的CV值为9.1%.在本实验中,我们首次尝试着用客观的数据来表示正常人中1×106个PBMCs中TNF-α mRNA的平均表达量,发现该表示方法直观明了,结果稳定,而且简便可行,不需要特殊的仪器及昂贵的试剂.结论: 本方法具有高灵敏度、高特异性、精确、简单易操作,结果数据化等优点,适合于微量细胞因子mRNA 的定量检测.

关键词：酶联夹心杂交、聚合酶链反应、肿瘤坏死因子

所属期刊栏目：19

分类号：R363(病理学)

资助基金：浙江省自然科学基金397510;浙江省温州市科技攻关项目

在线出版日期：2004-01-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共3页

页码：1289-1291