滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究

摘要：

目的 克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达.并用Real-time PCR法检测eDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量.方法 以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为eDNA.以cDNA为模板,根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物,对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建pEASY-E1-SE表达载体,利用ArtMedia protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达.Real-time PCR法检测eDNA样本中SE1和SE2基因的相对量.结果 获得了2条滇重楼SE基因,命名为ppSE1和ppSE2.ppSEl的全长为1 932 bp,开放阅读框(ORF)为1 578 bp,编码525个AA;ppSE2的全长为1 828 bp,ORF长为1 548 bp,编码515个氨基酸.荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异,ppSE1的表达在叶中最为显著.酶切和测序结果表明,原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在BL21 (DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白.结论 克隆了滇重楼的SE基因,获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白.ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用.

关键词：滇重楼、鲨烯环氧酶、基因克隆、原核表达、荧光定量PCR

所属期刊栏目：48

分类号：R282.12(中药学)

资助基金：国家自然科学基金资助项目81160502;云南省自然科学基金资助项目2011FZ153;云南省教育厅自然科学基金资助项目2013J040;云南省教育厅自然科学基金资助项目2014J063

在线出版日期：2017-07-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：1839-1844