小鼠Pim-3基因siRNA慢病毒载体的构建及表达

摘要：

目的:本研究拟构建针对Pim-3基因的siRNA慢病毒载体,诱导靶细胞中Pim-3基因沉默.方法:分析Pim-3 mRNA序列特征,根据siRNA设计原则,设计并合成特异性针对小鼠Pim-3的siRNA靶DNA序列及阴性对照序列.用限制性核酸内切酶将pGCSIL-GFP载体线性化,将寡DNA片段退火成含有粘性末端的DNA双链后,与慢病毒骨架质粒连接转化至大肠杆菌中进行重组,运用PCR技术筛选阳性克隆并测序,得到pSC-Pim-3 shRNA质粒.采用脂质体将pSC-Pim-3 shRNA质粒和辅助包装质粒共转染到HEK293细胞中包装形成慢病毒.采用倍比稀释法测定慢病毒滴度.慢病毒感染NIH3T3细胞,运用实时定量PCR技术检测Pim-3基因mRNA表达水平,运用蛋白免疫印迹技术检测Pim-3蛋白表达水平.结果:酶切后获得7.5 kb的pGCSIL-GFP片段.DNA片段成功连接到pGCSIL-GFP载体；重组慢病毒的滴度约为2×109 TU/mL.慢病毒能够高效感染靶细胞,并显著抑制内源性Pim-3基因的mRNA(抑制率超过70％)和蛋白(抑制率超过80％)表达.结论:针对Pim-3基因靶序列CCTCTTCGACTTCATCACT的shRNA重组慢病毒能够有效沉默靶细胞Pim-3基因.

关键词：Pim-3、RNA干扰、慢病毒载体

所属期刊栏目：31

分类号：Q782(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金30900631;湖北医药学院研究生启动金2010QDJ32

在线出版日期：2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：186-190,196,封2