PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒

摘要：

目的:将PCR 扩增产物人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)cDNA定向克隆到载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以构建重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP. 方法:在扩增目的基因的PCR引物5′端加上与线性化载体同源的15个碱基, 使PCR反应产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列.EcoR Ⅰ酶切质粒pHCMVsp1A-heNOS,回收heNOS cDNA作为模板,进行PCR扩增.将纯化的PCR产物heNOS cDNA与EcoR V酶切后的线性化载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以摩尔数为8∶1 比例混和,在重组酶作用下,25 ℃反应30 min,将PCR产物定向克隆入目标载体pShuttle-IRES-hrGFP-2上,获得阳性重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP.重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定. 结果:经鉴定, 成功构建出重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP. 结论:无需传统的酶切、连接、载体去磷酸化等手段, 利用PCR产物靶向克隆法,可快速、高效完成PCR 产物的定向克隆.

关键词：多聚酶链式反应、靶向克隆、人内皮型一氧化氮合酶

所属期刊栏目：27

分类号：Q781(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金30600614;教育部科学技术研究项目207072;湖北省自然科学基金2006ABA342;教育厅中青年项目Q200624003;郧阳医学院博士研究生启动金2006QDJ09;十堰市人民医院研究生启动金资助项目5

在线出版日期：2008-07-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：102-105,119,封3