体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体

摘要：

目的:采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ,为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础.方法:PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒,回收4.6 kb的LacZ基因表达盒,与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接,连接产物用SwaⅠ酶切,最终产物转化DH5α.重组质粒用PCR法和PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切鉴定.pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后,用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ.采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况.结果:PCR扩增可见312 bp特异性条带,PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒.X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Adeno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达.结论:体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法,本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础,Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体.

关键词：体外连接、腺病毒、β-半乳糖苷酶、PI-SceⅠ、I-CeuⅠ

所属期刊栏目：25

分类号：Q784(基因工程（遗传工程）)

资助基金：湖北省自然科学基金2000J056

在线出版日期：2006-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：65-69,封二