利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒

摘要：

目的: 利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础. 方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT 全长cDNA.将扩增的CAT cDNA 与dATP 反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT.人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1,然后酶切鉴定.pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实. 结果: 获得pET15b-PEP-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为"AY028632"的CAT cDNA序列一致. 结论: pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白His tag-PEP -1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础.

关键词：同尾酶、过氧化氢酶、TA克隆、DNA重组、PEP-1肽

所属期刊栏目：25

分类号：Q784(基因工程（遗传工程）)

在线出版日期：2006-04-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：1-5,封二