播娘蒿转录因子DsCBF1突变体的构建及其蛋白质的EMSA试验分析
CBF(C-repeat binding factor)是调控植物冷驯化相关基因表达的调控转录激活因子,可与下游冷应答基因启动子的核心序列CBT/DRE元件(CCGAC)特异性地结合,启动耐寒基因的表达,提高植物的抗寒能力.为揭示播娘蒿(Descurainia sophia)的抗寒机制,研究播娘蒿转录因子DsCBF1蛋白AP2区域编码氨基酸对启动下游抗寒基因表达的作用.首先分析DsCBF1蛋白AP2区域编码氨基酸的疏水性,设计重叠延伸PCR引物,定点突变DsCBF1基因;然后构建pET32a-DsCBF1突变体原核表达载体,通过冻融法转化入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,进行原核表达,并通过镍离子亲和层析纯化DsCBF1突变体蛋白;最后利用化学发光法EMSA试验(Electrophoretic mobility shift assay)方法分析DsCBF1蛋白与含有CR T/D RE元件的DNA探针之间的相互作用.EMSA试验分析显示,播娘蒿DsCBF1的AP2区域的57位苯丙氨酸F(TTT)和68位缬氨酸V(GTT)分别突变为精氨酸R(CGT)和谷氨酸E(GAA),导致播娘蒿顺式调控因子DsCBF1蛋白与下游冷响应基因的CRT/DRE元件结合效率出现明显下降趋势,说明播娘蒿DsCBF1蛋白AP2区域编码氨基酸位点的突变影响了播娘蒿的抗寒能力.本研究表明播娘蒿DsCBF1的AP2区域的57位苯丙氨酸F(TTT)和68位缬氨酸V(GTT)位点对于播娘蒿的冷驯化具有十分重要的作用.
播娘蒿、CRT/DR元件、AP2区域、重叠延伸PCR、pET32a-DsCBF1突变体、EMSA
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Q945.78;Q78(植物学)
国家自然科学基金项目31171447和四川省科技厅项目2014GZX0005、2015JPT0032、15010302资助 Supported by the National Natural Science Foundation of China 31171447 and the project of the Science and Technology Department of Sichuan Prouince 2014GZX0005,2015JPT0032,15010302
2016-07-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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