二甲基酚橙法测定尿酸酶活性和识别尿酸酶高活性突变体
考察了采用二甲基酚橙测定过氧化氢(Xylenol-orange-assay-of-hydrogen-peroxide,XOAHP)法测定尿酸酶活性的可靠性以及识别高活性尿酸酶突变体的方法.将苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidious)尿酸酶4种突变体成对组合,使其催化效力比值在1.3-4.1间变化；将每种突变体表达载体转化大肠杆菌,取30个克隆分别转移到1.0 mL液体培养基放大,18℃诱导表达16h,收集细胞后超声裂解得裂解液.在pH 8.9的Tris-HC1缓冲液中0.33 mmol/L以下尿酸对XOAHP法测定尿酸酶活性无干扰.SDS-PAGE分析发现不同突变体蛋白表达丰度有差异,酶活性同裂解液中总蛋白浓度正相关.Receiver-operation-curve (ROC)分析发现尿酸酶间催化效力比值越大,则所得曲线下面积(Area-under-the-curve,AUC)越接近1.00,此比值接近1.8时AUC约0.95.以突变体与起始物的酶活性浓度差值超过起始物标准差1.4倍为阈值,能识别催化效力达起始物1.8倍以上的突变体.因此,用XOAHP法测定裂解液中尿酸酶活性,以起始物活性均值加标准差1.4倍为阈值,有望高通量筛选尿酸酶突变体库.
尿酸酶、二甲基酚橙法、突变体、高通量筛选、阳性突变体阈值、ROC曲线
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Q946.54;Q816(植物学)
重庆市科委自然科学基金重点项目CSTC2011BA5039;国家自然科学基金项目30672009;教育部新世纪优秀人才支持计划项目NCET-09-0928;the Natural Science Foundation Project of ChongqingCSTC2011BA5039;the National Natural Science Foundation of China30672009;the Program for New Century Excellent Talents of the Ministry of EducationNCET-09-0928
2013-08-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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