烯酮还原酶基因的克隆与优化表达
烯酮/酯还原酶可以专一性地还原烯酮/酯中的碳碳双键,并引入两个手性中心,是手性化合物生物催化合成的重要酶类之一;在使用烯酮/酯还原酶进行全细胞手性分子生物催化合成中,其他还原酶的存在常导致副反应的产生.为研究烯酮/酯还原酶的理化性质、底物的专一性、产物的手性特点等,需要经过纯化的烯酮/酯还原酶.为此,根据烯酮还原酶(Enoate reductase,Ers,EC 1.3.1.31)的基因序列设计引物,以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到了目标酶的基因,目的片段全长为1 995 bp,共编码664个氨基酸,相对分子质量为73×103.将烯酮还原酶基因连接到pET-32a(+)上,构建表达质粒pET-32a(+)-Ers,并成功在Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS中表达.在摇床上优化的表达条件为:诱导温度为18 ℃,诱导起始时菌体D600nm为0.6～0.8,转速为100 r/min,诱导剂IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导培养时间为12 h,表达的烯酮还原酶大部分以可溶性形式存在于菌体内.
烯酮还原酶、优化表达、不对称还原、C=C双键、丙酮丁醇梭菌
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Q936;Q78(微生物学)
中国科学院知识创新工程重要方向项目;天津市科委科技支撑计划;国家科技支撑计划
2011-06-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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