精氨酸甲基转移酶CARM1 shRNA慢病毒表达质粒的构建及稳定敲低CARM1的小鼠畸胎瘤P19细胞系的建立
目的 构建慢病毒表达小鼠CARM1基因shRNA的质粒,观察其在小鼠畸胎瘤P19细胞中对CARM1的表达抑制效率.验证CARM1 shRNA慢病毒表达质粒,进一步筛选得到稳定敲低CARM1的小鼠畸胎瘤P19细胞系.方法 设计并且合成针对小鼠CARM1 mRNA不同部位的4组shRNA序列,以Age Ⅰ和EcoR Ⅰ克隆入pLKO.1慢病毒载体中,得到含shRNA的慢病毒表达质粒.氨苄青霉素筛选后,DNA测序鉴定结果.鉴定正确的质粒大量制备后,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共同转染HEK293T细胞,包装得到具有感染能力的慢病毒.将含病毒的培养基上清感染P19细胞后,经嘌呤霉素筛选获得CARM1稳定敲低的P19细胞系,并用Western blot法和实时荧光定量PCR进行鉴定.结果 测序鉴定表明4组CARM1 shRNA慢病毒表达质粒构建成功.Western blot法检测和实时荧光定量PCR分析结果显示4组CARM1 shRNA慢病毒表达载体中的2组可有效地抑制小鼠畸胎瘤P19细胞中CARM1基因的表达,即pLKO.1/CARM1 shRNA2、pLKO.1/CARM1 shRNA3有明显的抑制效果.结论 成功构建了针对CARM1基因的shRNA的慢病毒表达质粒并筛选得到稳定敲低CARM1表达的P19细胞系,为进一步研究CARM1基因的功能奠定了基础.
CARM1、shRNA、慢病毒、小鼠畸胎瘤P19细胞
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R3(基础医学)
教育部博士点博导类基金资助项目20111106110024
2014-08-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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