慢病毒介导的大鼠前强啡肽基因在骨髓间充质干细胞中的表达

摘要：

目的 强啡肽镇痛效应强、安全性好、无呼吸抑制和成瘾性等优势,是目前生物镇痛研究的重点.探讨慢病毒介导的大鼠前强啡肽(PDYN)基因在骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)中的表达,为后续研究大鼠癌痛模型的生物镇痛提供条件.方法 采用贴壁筛选法分离和扩增BM-MSCs,流式细胞学和体外成脂、成骨细胞诱导分化实验鉴定.构建大鼠PDYN慢病毒载体并感染BM-MSCs,倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达和Western blot法筛选最适感染复数(MOI);实验分为空白组(BM-MSCs)、实验组(PCDH-CMV-PDYN-EF1-copGFP)、空载体组(PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP),采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和Western blot检测PDYN表达变化,采用免疫细胞化学染色法检测强啡肽蛋白表达.结果BM-MSCs呈长梭形纤维细胞样贴壁生长,多数表达CD29、CD44、CD90,少数表达CD45.成脂诱导培养后油红O染色为阳性;成骨诱导培养后出现矿化结节,经茜素红染色呈橘红色.流式细胞仪检测示BM-MSCs细胞中CD29、CD90、CD44、CD45阳性率分别为(99.80±0.19)%、(99.62±0.24)%、(96.86±1.27)%、(0.82±0.06)%,转染PDYN基因后BM-MSCs表面标记CD29、CD90、CD44、CD45阳性率分别为(99.59±0.34)%、(98.06±1.51)%、(95.23±0.71)%、(10.23±0.59)%,转染前后BM-MSCs干细胞特性差异无统计学意义(P>0.05).经PCR扩增克隆测序鉴定慢病毒载体PCDH-CMV-PDYN-EF1-copGFP构建成功,重组慢病毒滴度为5×106IU/mL.绿色荧光蛋白的表达和Western blot结果示慢病毒MOI=100为最佳病毒感染复数.qPCR、West-ern blot检测到经慢病毒载体感染后的BM-MSCs中PDYN基因表达均上调(P<0.05),免疫细胞化学染色检测显示强啡肽蛋白表达显著增强.结论 成功培养 BM-MSCs和构建大鼠 PDYN基因过表达慢病毒载体,在 BM-MSCs中能高效稳定表达PDYN基因和分泌强啡肽蛋白.

关键词：前强啡肽、强啡肽、骨髓间充质干细胞、载体构建、慢病毒

所属期刊栏目：30

分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)

资助基金：广东省省级科技计划项目2013B021800206

在线出版日期：2017-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：138-144