靶向 EphB4的慢病毒干扰载体对结肠癌细胞中 EphB4及 EphrinB2表达的影响

摘要：

目的：有研究显示EphB4在肿瘤发生发展中的作用与其配体EphrinB2密切相关。文中主要通过慢病毒介导的RNA干扰技术干扰结肠癌细胞中EphB4基因的表达，观察EphB4基因表达改变对其配体EphrinB2表达的影响。方法根据EphB4基因序列设计并合成3对miRNA的oligo DNA，退火形成双链后与pcDNA6．2-GW/EmGFP-miRNA载体相连并瞬时转染HEK293细胞，通过荧光显微镜、qPCR筛选出干扰效率最高的质粒，将其与中间载体pDONR221和慢病毒载体pLenti6/V5-DEST连接构建慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-EphB4。用脂质体将慢病毒载体以及包装质粒（ pLP1、pLP2和pLP/VSVG）共转染293 FT细胞，收集上清Lenti-miR-EphB4感染HEK293细胞株进行滴度鉴定。将获得的病毒液感染人结肠癌细胞株，通过荧光显微镜和qPCR检测结肠癌细胞中EphB4及其配体EphrinB2的表达变化。结果测序结果表明3对干扰载体SR1、SR2、SR3序列与参考序列一致，成功转染HEK293细胞后，各转染组细胞荧光显微镜下均可见到绿色荧光蛋白表达；qPCR显示载体 SR-3的沉默效率最高；构建出来的慢病毒载体pLenti6．3/V5-DEST-miR-EphB4在293FT细胞中包装成功，所得慢病毒滴度为7×108 TU/mL；Lenti-miR-EphB4浸染后，SW480和Caco-2中EphB4 mRNA相对表达量（0．49±0．02、0．62±0．04）均较原始SW480（1．00±0．00）和Caco-2降低（1．00±0．00），差异有统计学意义（P＝0．000）；SW480中EphrinB2 mRNA表达量F （2．11±0．04）较原始SW480（1．00±0．00）明显升高（P＝0．000）；而Caco-2细胞中EphrinB2 mRNA表达无明显改变（1．01±0．02），差异无统计学意义（P＝0．315）。结论靶向EphB4的慢病毒干扰载体能够有效降低SW480及 Caco-2细胞中EphB4 mRNA表达水平。 EphB4与其配体EphrinB2之间的相互作用可能受到多种因素调控，有待后续深入研究。

关键词：EphB4、EphrinB2、结肠癌、慢病毒载体、RNA干扰

分类号：R735(肿瘤学)

资助基金：国家自然科学基金81171391，81372743，81371611；中国博士后科学基金2012T50895

在线出版日期：2014-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：1011-1015