Annexin A4-EGFP融合蛋白的表达纯化及其凋亡检测能力初探

摘要：

膜联蛋白(annexin)是一类进化保守的多基因家族蛋白,可与细胞膜磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl-serine,PS)结合,由于PS与许多重要疾病密切相关,具有作为药物发现新靶点的潜力,使得annexin具有良好的药物发现价值和新药研发前景.AnnexinA4(以下称A4)是膜联蛋白家族成员之一,参与多项细胞功能,如胞吐作用和凝血反应,所有这些功能与膜联蛋白可结合酸性磷脂的能力相关.目前对A4的功能尚不完全了解,获得足量的A4是深入了解A4的结构与功能的基础.为了克服传统从生物组织中提纯人源A4的方法得率不高,且较为复杂等问题,本文通过原核系统重组表达A4,以获取大量可溶性蛋白,探究其与PS的结合能力,为后续研究奠定基础.利用分子生物学的手段构建融合表达质粒pET28a-annexin A4-EGFP,大量表达、选用并比较了两种获取可溶性annexin A4-EGFP(以下称A4-EGFP)融合蛋白的纯化方法,同时检测A4-EGFP对凋亡细胞的识别能力.通过亲和层析纯化获得纯度为80％的A4-EGFP;而选用膜吸附纯化方式,最终获得了纯度达90％的蛋白.流式细胞仪检测结果显示:A4-EGFP融合蛋白可识别和标记早期凋亡细胞,其与PS亲和力为79.58±11.68nmol·L-1,与A5-EGFP和PS的亲和力同处一个数量级.本文成功实现了A4-EGFP在原核体系中的高效可溶性表达,建立了简易、高效的分离纯化方法,获得了产率高达75.2 mg·L-1的A4-EGFP,为深入研究A4的功能及其潜在的应用奠定了基础.

关键词：膜联蛋白A4、原核表达、纯化、凋亡检测、序列比对

所属期刊栏目：52

分类号：R966(药理学)

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金;国家重点基础研究发展计划（973计划）

在线出版日期：2017-07-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：904-910