应用核糖体展示技术高效筛选人源抗IgE单链抗体

摘要：

本研究从哮喘患者外周血分离淋巴细胞、提取总mRNA,采用RT-PCR技术分别构建重链可变区VH(variable region of heavy chain)和轻链可变区VL (variable region of light chain) cDNA库,然后通过连接肽(Gly4Ser)3和特定引物将VH和VL cDNA基因组装成人源单链抗体(scFv)核糖体展示模板基因库.应用兔网织红细胞核糖体展示技术,单引物原位反转录技术,经3轮展示富集并回收针对人源IgE蛋白(免疫球蛋白E)的目的单链抗体基因;回收的抗体基因经双酶切后与pET22b(+)载体连接,转化至E coli Rosseta (DE3)宿主细胞,应用菌落PCR结合Dot blotting技术快速鉴定阳性克隆,抗原ELISA法进一步鉴定阳性克隆.VH和VL基因库得到正确的构建,长度分别为400和710 bp,库容为1013.核糖体展示模板构建正确,长度为1 100bp.该基因库经过3轮针对IgE蛋白的核糖体展示,目的基因得到了有效富集和回收.经过高效克隆、表达和鉴定,确定1株针对人IgE蛋白显示最强亲和力的阳性克隆菌pET-IgE-6.经测序和序列分析证实该单链抗体为人源抗体,序列未见国内外报道.结果表明,采用患者外周血构建人源抗体基因库,结合核糖体展示技术,可以成功获得高亲和力的人源单链抗体分子.该技术路线为快速获得具有药用价值的人源抗体提供了参考.

关键词：免疫球蛋白E、人源抗体、核糖体展示技术、过敏性疾病

所属期刊栏目：47

分类号：R963(药理学)

资助基金：国家"重大新药创制"科技重大专项2011ZX09506-005;中国医药集团新产品基金资助项目2011SW12-1

在线出版日期：2013-01-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：1329-1335