引入糖基化位点和L303E/F309S突变促进intein介导的断裂凝血Ⅷ因子剪接

摘要：

作者最近证明intein的蛋白质剪接技术可用于双载体转B区缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)基因.在此基础上,本研究将具有促FⅧ分泌作用的L303E/F309S双突变和B结构域糖基化位点引入BDD-FⅧ重链,观察重链变体对intdn剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性的影响.用分别融合Ssp DnaB intein的重链变体(DMN6HCIntN)和轻链(IntCLC)基因共转染培养的293细胞,用ELISA分析分泌至培养上清液中的剪接BDD-FⅧ蛋白量,并用发色法检测培养上清液的凝血生物活性.结果显示,DMN6HCIntN和IntCLC共转基因细胞上清液中剪接BDD·FⅧ的浓度为(149±23)ng·mL-1,活性为(1.12±0.14)u-mL-1,明显高于intein融合的野生型重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)共转基因细胞”(99±14)ng·mL-1和(0.77±0.13)u-mL-1”,提示重链变体能明显促进剪接BDD-FⅧ蛋白的分泌和活性;另外,还检测到不依赖细胞机制的BDD-FⅧ剪接.本研究为进一步动物体内双AAV载体转BDD-FⅧ基因研究提供了依据.

关键词：凝血Ⅷ因子、重链变体、分泌、intein、蛋白质剪接

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分类号：R963(药理学)

资助基金：山东省自然科学基金ZR2010C”M06I;烟台市科技计划项目2008152;教育部留学回国人员科研启动基金20071108;鲁东大学科研基金LZ20083305

在线出版日期：2010-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：1361-1366