10.16155/j.0254-1793.2021.07.10
慢病毒载体生产用质粒DNA构象检测毛细管凝胶电泳法的建立及验证
目的:建立可定量检测质粒DNA超螺旋构象相对百分含量的毛细管凝胶电泳法(CGE),并开展方法学验证研究及初步应用探讨.方法:选用涂层毛细管,采用荧光检测器CGE法分离质粒DNA,首先通过限制性内切酶和缺刻酶处理法确认质粒DNA超螺旋(covalently closed circular,ccc)、线性(linear)及开环(open circular,oc)这3种构象在电泳图谱中的位置,然后通过对荧光染料、样品上样浓度等条件进行优化,建立质粒DNA构象的检测方法.对所建方法进行专属性、准确性、线性、精密度、检测下限和定量下限验证,并通过将质粒DNA置于不同保存温度、反复冻融及紫外照射后再进行质粒DNA构象的检测,初步分析该方法应用的可行性.结果:采用总长度为40 cm、有效长度为30.2 cm涂层毛细管,毛细管和样品上样温度分别为20℃和4℃,质粒浓度为4 ng·μL-1以1 378.95 Pa,4 s上样分离,CGE法可准确地定量质粒DNA 3种构象所占的比例,且分离度良好.通过对3种常用的质粒保存液基质的检测结果显示,这些基质不会干扰检测结果,专属性较好.质粒DNA3种构象的线性范围均在0.25～8 ng·μL-1,构象峰面积与上样浓度具有良好的线性关系,相关系数分别是0.997 7、0.999 4、0.992 7.将线性化质粒及开环质粒分别以3％～50％添加至原质粒中,可检出的线性及开环构象的峰面积与添加浓度呈现良好的线性关系,相关系数分别为0.9999和0.997 2,线性构象的回收率在104％～120％,准确性良好;开环构象的回收率稍差,为68％～94％.将质粒DNA分别以高(4μg·mL-1)、中(2μg·mL-1)、低(0.5 μg·mL-1)3个浓度验证实验的重复性,结果显示,试验内重复性良好,质粒DNA超螺旋构象迁移时间的RSD在0.22％～0.54％,相对百分含量的RSD在0.38％～2.1％;中间精密度也较好,迁移时间的RSD在0.52％～1.1％;相对百分含量的精密度在质量浓度为2 ng·μL-1和4 ng·μL-1时,RSD值分别为3.6％、0.25％.灵敏度的验证结果显示,定量下限及检测下限分别为0.5 ng·μL-1和0.25 ng·μL-1.用该方法分别检测质粒DNA在不同保存条件、冻融及紫外照射后的构象变化,结果显示,质粒DNA在-80℃、-20℃保存1周,超螺旋构象无明显变化,但在室温保存1周后,质粒DNA开环构象含量从1.39％增加到4.16％;将质粒DNA反复冻融5次,未观察到明显的构象变化,但冻融7次后,质粒DNA开环构象相对百分含量从1.3％左右增加到1.93％;质粒DNA质量浓度在1 mg·mL-1时,紫外照射15 min到3 h,质粒DNA的超螺旋构象相对百分含量从96.97％下降到54.38％,同时线性及开环构象明显增加.结论:本研究建立的毛细管凝胶电泳法可以很好地将质粒DNA的超螺旋、线性及oc 3种构象分离,各构象分离度良好,可准确定量不同构象相对百分含量,线性相关系数不低于0.99,灵敏度高,可重复性好,且可灵敏地反映出质粒DNA构象的变化,可用于质粒DNA构象纯度检测的质量控制.
毛细管凝胶电泳;质粒DNA;慢病毒载体;拓扑结构;超螺旋构象;线性构象;开环构象;定量检测
41
R917(药物基础科学)
国家药典委员会2020年药典标准提高课题1041740404401
2021-09-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共14页
1189-1202
