ICC-qPCR病毒灭活验证方法的建立及其应用

摘要：

目的:建立细胞培养-核酸扩增荧光定量PCR(integrated cell culture quantitative PCR,ICC-qPCR)病毒灭活验证方法;结合传统细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)法,考察ICC-qPCR方法的适用性;利用这2种方法验证复用电生理导管环氧乙烷病毒灭活工艺的有效性.方法:通过制备指示病毒(伪狂犬病毒,PRV)质粒DNA作为定量标准品,用PRV特异性引物建立定量PCR方法;再用PRV病毒侵染宿主细胞,同时用热灭活PRV作为对照,确定PRV活病毒全部进入宿主细胞但不扩增的最佳样本收获时间,通过检测细胞中活病毒,建立ICC-qPCR活病毒检测方法;确立CPE法测定滴度与ICC-qPCR法检测DNA拷贝数之间的线性关系.最后,模拟临床使用的最坏情况对一次性电生理导管进行含指示病毒(PRV)生物污染物负载,模拟环氧乙烷病毒灭活工艺,通过ICC-qPCR和CPE法验证病毒灭活工艺的有效性.结果:本研究中建立的ICC-qPCR方法的标准曲线线性关系r2＞0.99;定量下限为104 copies·μL-1,约相当于2 logs·mL-1,检测下限为103copies·μL-1,约相当于-1 logs·mL-1;特异性结果表明只能检测到PRV的扩增曲线,无非特异性扩增;重复性试验的RSD＜5％.确定ICC-qPCR方法中PRV最佳收获时间为宿主细胞染毒后1～2h.ICC-qPCR检测拷贝数与病毒滴度间具有良好的线性关系(r2＞0.99).ICC-qPCR法病毒灭活工艺验证结果表明:经环氧乙烷灭活后病毒负载导管其病毒滴度降低＞9.0 logs;阴性对照组(负载不合PRV生物污染物)和空白导管样品均未检出病毒DNA.CPE法的病毒滴定结果表明,经环氧乙烷灭活后病毒负载导管其病毒滴度降低≥8.5 logs·mL-1;阴性对照组和空白导管样品均未检出PRV.结论:本研究建立的ICC-qPCR方法应用于PRV病毒灭活验证,可以有效检测活病毒,比传统CPE法(-0.5 logs· mL-1)灵敏度高.将此方法应用于复用电生理导管的环氧乙烷病毒灭活工艺验证,同时与CPE法进行比较,验证了ICC-qPCR方法的适用性以及环氧乙烷灭活电生理导管负载的PRV病毒的工艺有效性.

关键词：伪狂犬病毒(PRV)、病毒灭活验证、细胞培养-核酸扩增荧光定量PCR(ICC-qPCR)、细胞病变效应(CPE)、病毒滴度、DNA拷贝数、复用电生理导管

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分类号：R917(药物基础科学)

资助基金：中青年基金;国家科技重点研发计划;中国药品监督管理研究会课题

在线出版日期：2019-05-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：398-405