蛋白酶消化结合荧光定量PCR法和杂交法检测重组人胰岛素中E.coli细胞DNA残留量的比较

摘要：

目的:利用蛋白酶K消化结合荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)技术,检测重组人胰岛素原料中E.coli细胞DNA残留量,并进行初步的方法学验证,与狭缝杂交-放射自显影方法进行比较.方法:通过蛋白酶K消化样品,利用核酸纯化提取试剂盒提取DNA,然后采用Taqman探针法对样品和标准DNA进行定量PCR测定,再根据标准曲线对样品中DNA残留量进行分析.对方法进行线性、范围、准确度和精密度的验证,对重组人胰岛素中DNA残留量进行测定.结果:该方法检测E.coli细胞DNA残留的最低定量限度为0.03 pg· μL-1,DNA含量在0.03～2.25×103 pg· μL-1范围内线性关系良好,相关系数在0.98以上;该方法检测不同加标样品回收率较接近,3次测定的相对标准偏差均小于20％;该方法检测各批次重组人胰岛素的DNA残留量均小于10 ng·剂量-1,而狭缝杂交——放射自显影法50 pg(标准DNA)均未出现条带.结论:蛋白酶消化结合试剂盒洗脱解决了残留DNA检测中样品前处理的难题,定量PCR检测可能代替杂交法,快速、准确、灵敏地对重组人胰岛素原料中E.coli细胞残余DNA进行定量测定,为将来荧光定量PCR检测药物中宿主DNA残留方法标准化奠定了基础.

关键词：蛋白酶消化、定量聚合酶链式反应(q-PCR)、狭缝杂交、重组人胰岛素、E.coli细胞、DNA残留量比较

所属期刊栏目：37

分类号：R917(药物基础科学)

资助基金：重大新药创制"科技重大专项2014ZX09304311

在线出版日期：2017-06-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：846-851