抗人TNF-α单克隆抗体液质联用肽图分析方法的建立及验证

摘要：

目的:建立液相色谱-质谱联用肽图分析方法,用于抗人肿瘤坏死因子α(Tumor necrosisfactor alpha,TNF-α)单抗的专属性鉴别.方法:TNF-α单抗样品经盐酸胍变性、还原,释放出的游离半胱氨酸残基进行烷化,还原剂中和过量的烷化剂.超滤置换酶切缓冲液后进行胰酶酶切并终止.色谱条件:采用WatersUPLC BEH 300 C18(2.1 mm×150 mm,1.7μm)色谱柱,以o.1％甲酸水溶液(A)-0.1％甲酸乙腈溶液(B)为流动相,梯度洗脱(5～120 min,2％B→45％B),流速为0.2 mL· min-1,检测波长为214啪;质谱条件:采用电喷雾离子源及正离子模式,数据采集范围m以为100～1 990.结果:TNF-α单抗重链及轻链的6个互补决定区(CDR)对应肽段由质谱鉴定出,HC CDP2及HC CDP3在色谱峰图中共流出;利妥昔单抗用于评估本方法的专属性,结果显示本方法专属性强,且不受基质的干扰;选定m/z1 344(M+5)的色谱峰为参考峰,根据CDR的相对保留时间考察该方法的变异程度,5次重复测定CDR相对保留时间的RSD在0.57％～1.19％之间;中间精密度考察测定的相对保留时间的RSD在0.00％～1.08％之间;胰酶酶切比例在20∶ 1～30∶1,酶切时间在17～23 h范围内变化时,相对保留时间的均较小,符合方法耐用性的要求;样品消化后在8℃储存24h以及-20储存5d的稳定性良好.结论:基于CDR相关肽段鉴别的液质联用肽图分析方法可定性鉴定出TNF-α单抗,方法学验证结果显示该方法适用于抗人TNF-α单抗的专属性鉴别,可用于其质量控制及批检验放行.

关键词：单克隆抗体、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、抗人TNF-α单抗、液质联用、肽图分析、互补决定区(CDR)、鉴别试验、方法学验证

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分类号：R917(药物基础科学)

资助基金：国家科技重大专项课题资助项目2011ZX09506-005

在线出版日期：2017-03-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：51-63