人细胞色素P450 CYP2C19与CYPOR、CYPb5共表达模型的构建及其抑制剂筛选

摘要：

目的:获得人细胞色素P450 2C19(CYP2C19)蛋白重组酶,用特征性底物表征重组酶活性,并将该重组酶用于天然产物CYP2C19抑制剂的筛选.方法:构建含人CYP2C19基因的重组杆状病毒穿梭质粒,使用昆虫细胞-杆状病毒表达系统共表达人CYP2C19、细胞色素氧化还原酶(CYPOR)和细胞色素b5(CYPb5);用蛋白印迹分析(Western Blot)鉴定重组酶的表达;以奥美拉唑为底物进行代谢孵育,HPLC分析鉴定酶的活性;并使用该重组蛋白对70种天然产物进行抑制能力的筛选.结果:Western Blot结果显示重组人CYP2C19蛋白在Sf9细胞中成功表达,该重组酶代谢经典底物奥美拉唑的酶动力学参数分别为:米氏常数Km为(4.99±0.22)μmol·L-1,最大反应速率Vmax为(0.2539 ±0.0024) μmol·min-1·mg-1蛋白,表观清除率CLint值为0.0509 L·min-1·mg-1蛋白.对70种天然产物的抑制筛选实验显示白藜芦醇、大黄素、异土木香内酯、莪术醇、薄荷脑、鬼臼毒素、补骨脂素、五味子甲素、五味子乙素、新狼毒素B等对人CYP2C19有比较明显的抑制能力.结论:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统,可获得代谢活性良好的重组人CYP2C19蛋白,该重组酶可进一步用于其他底物的Ⅰ相代谢研究以及各种抑制剂的筛选.

关键词：人细胞色素、蛋白重组酶、昆虫细胞-杆状病毒表达系统、蛋白印迹分析、HPLC法酶活性鉴定、奥美拉唑底物、天然产物抑制剂筛选、酶动力学参数

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分类号：R917(药物基础科学)

资助基金：国家重大专项2012ZX09506001-004,2009ZX09304-003;国家自然科学基金81173120

在线出版日期：2013-03-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：2099-2107