慢病毒表达质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP的构建及其在NIH3T3细胞中的表达
目的:构建携带人白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)的慢病毒表达质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP,并检测其在NIH3T3细胞中的表达.方法:采用PCR技术从含有人IL-1ra基因的质粒pEGFP-NI-IL-1ra中扩增目的基因IL-1ra,并将该基因克隆至慢病毒表达质粒pLenti,PCR及DNA测序来鉴定构建的重组质粒pLenti-IL-1ra.从质粒PMIG中切取IRES-GFP基因片段,插入鉴定正确的质粒pLenti-IL-1ra中以构建重组质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP.将构建成功的慢病毒表达质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP、包装质粒△8.91、包膜质粒pVSVG共转染293T细胞.获取携带IL-1ra基因的重组慢病毒Lenti-IL-1ra-IRES-GFP,并感染NIH3T3细胞.荧光倒置显微镜下观察荧光蛋白的表达.灭瘟素(Blasticidin)筛选15d,RT-PCR检测目的基因的表达,ELISA检测目的蛋白的表达.结果:PCR及DNA测序结果均表明人IL-1ra基因与质粒pLenti正确重组;IRES-GFP基因经PCR鉴定已成功插入质粒pLenti-IL-1ra;三质粒共转染293T细胞可获得重组慢病毒.慢病毒感染NIH3T3细胞后,荧光倒置显微镜下能直接观察荧光蛋白的表达,RT-PCR和ELISA分别检测到IL-1ra在基因水平和蛋白水平的表达.结论:成功构建了携带人IL-1ra基因的慢病毒表达质粒pLenti-IL-1ra-IRES-GFP,并获得了稳定表达目的蛋白人IL-1ra的NIH3T3细胞系,为牙周炎基因治疗的进一步研究奠定了实验基础.
IL-1ra、慢病毒表达质粒、牙周炎、基因治疗
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R780.2(口腔科学)
国家自然科学基金资助项目30700942;江苏省高校自然科学基金07KJB320076
2011-04-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
679-683
