振荡法分离小鼠视网膜色素上皮细胞提取总RNA的效果

摘要：

目的 探讨应用振荡法分离小鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞并进行总RNA提取的效果.方法 实验研究.应用机械法对4只小鼠眼制作眼杯,去除视网膜后应用RNA保护试剂及振荡的方法对小鼠RPE进行分离,将应用振荡法分离后的眼杯铺片,采用免疫细胞化学方法检测分离后RPE细胞残留情况;收集分离的细胞,提取总RNA.同时分别应用自发分离法、酶法、眼杯法各对4只小鼠眼RPE进行分离,提取总RNA,比较不同方法提取的RPE细胞总RNA量,并应用实时定量PCR方法对RPE细胞中RPE65、vWF及COL6A1 mRNA表达水平进行比较.数据采用单因素方差分析、独立样本t检验进行比较.结果 采用4种方法进行RPE分离得到的总RNA量差异有统计学意义(F=8.538,P＜0.01),免疫细胞化学方法证实应用振荡法可以使RPE细胞与脉络膜完全分离,得到的总RNA量为(234.47±49.13)ng,与自发分离法及酶法比较差异无统计学意义(P＞0.05),但低于眼杯法(P＜0.05).4种方法得到的RPE65的mRNA表达量差异有统计学意义(F=38.453,P＜0.01),通过实时定量PCR法检测振荡法RPE65的mRNA表达量与自发分离法相当(P＞0.05),低于酶法(P＜0.01),但要高于眼杯法(P＜0.01).体现脉络膜细胞污染程度的标志物vWF及COL6A1 mRNA相对表达量,4种方法差异有统计学意义(F=45.432、90.498,P＜0.01).振荡法vWF mRNA表达水平低于自发分离法(P＜0.05),与酶法相似(P＞0.05),远低于眼杯法(P＜0.01);COL6A1 mRNA表达水平与自发分离法及酶法相似(P＞0.05),远低于眼杯法(P＜0.01).结论 应用振荡法可有效分离小鼠RPE细胞,并最大限度地降低来自脉络膜的污染,经总RNA提取后可得到较多的总RNA量及较好的质量,此方法方便快捷、稳定性较好,适合小样本量的RPE细胞的基因转录水平分析.

关键词：视网膜色素上皮、细胞分离、小鼠、RNA提取

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资助基金：吉林省科技发展计划青年基金20130522012JHScience Fund for Young Scholars of Jilin Province 20130522012JH

在线出版日期：2016-03-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：19-24