外源性脯氨酸羟化酶对人RPE细胞中缺氧诱导因子通路的负向调节作用

摘要：

背景 目前抗VEGF药物的应用已广泛用于眼部新生血管性疾病发病的治疗,但有部分患者的疗效并不理想,因此研究VEGF的上游基因缺氧诱导因子-1(HIF-1)及其限速酶脯氨酸羟化酶(PHDs)在新生血管形成中的作用具有重要的临床意义. 目的 探讨外源性PHDs在HIF-1激活通路中的负性调节作用.方法用Hela细胞提取RNA,采用逆转录PCR法从cDNA克隆PHD1、PHD2和PHD3,通过限制性内切酶构建pFLAG-PHD1、pFLAG-PHD2和pFLAG-PHD3质粒并通过基因测序进行鉴定.分别将人RPE细胞株(ARPE-19)在体积分数21％ O2(常氧组)、1％ O2(低氧组)和缺氧模拟剂(CoCl2,缺氧组)条件下进行培养,将pFLAG-PHD1、pFLAG-PHD2和pFLAG-PHD3质粒分别转染至培养的ARPE-19细胞中,pFLAG-CMV2转染作为空白对照.采用Western blot法测定和比较转染细胞在不同氧环境培养下PHD1、PHD2和PHD3蛋白的表达强度;采用双荧光素酶报告系统评估各组细胞中HIF-1的转录活性. 结果 Western blot法检测显示常氧组、低氧组和缺氧组ARPE-19细胞中均有PHD1、PHD2和PHD3蛋白的表达,各组细胞中PHD2的表达条带均强于PHD1和PHD3蛋白,差异均有统计学意义(P＜0.05).pFLAG-CMX转染后常氧组细胞中内源性HIF-1活性反应低,低氧组和缺氧组细胞中HIF-1的转录活性明显升高,与空白对照组相比,pFLAG-PHD1、pFLAG-PHD2、pFLAG-PHD3转染后常氧组细胞中内源性HIF-1活性反应无明显变化(F=0.48,P＞0.05),而低氧及缺氧组细胞中HIF-1活性明显下降,与空白对照组比较差异均有统计学意义(F=24.30,112.67,均P＜0.05).相同培养条件下,pFLAG-PHD2转染后细胞中HIF-1活性明显低于pFLAG-PHD1和pFLAG-PHD3转染细胞,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 PHDs对人RPE细胞中HIF-1的激活通路有明显的负向调节作用,其对低氧细胞和缺氧细胞中HIF-1转录活性的抑制作用明显强于常氧细胞,其中PHD2抑制HIF调节通路的作用明显强于PHD1和PHD3.

关键词：细胞缺氧、血管内皮生长因子、基因表达调控、缺氧诱导因子-1、脯氨酸羟化酶/代谢、人、转录因子、视网膜色素上皮细胞

所属期刊栏目：34

分类号：R774.1;R33;R512.62

在线出版日期：2016-04-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：234-238