γ-氨基丁酸Rho2受体在神经母细胞瘤细胞中的稳定表达及其在谷氨酸盐致细胞死亡中的作用
目的 构建人 γ-氨基丁酸(GABA)Rho2受体(GABRR2)真核表达载体,并转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立稳定表达细胞株,探讨GABRR2在谷氨酸盐致细胞死亡中的作用.方法 采用快速克隆方法将人脑组织GABRR2基因克隆至pIRES2-eGFP质粒,构建重组质粒pIRES2-eGFP-Rho2,利用X-fect试剂盒将其转染至SH-SY5Y细胞中,使用遗传霉素进行筛选,建立稳定表达pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞株.使用流式细胞术检测稳定转染过表达pIRES2-eGFP-Rho2的细胞,利用免疫荧光法鉴定稳定转染的SH-SY5Y细胞中pIRES2-eGFP-Rho2的表达.将野生型SH-SY5Y细胞分为A1、B1、C1组,稳定表达pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞分为A2、B2、C2组,每组设3个平行孔,其中A1、A2组细胞使用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)孵育,B1、B2组细胞使用含有谷氨酸盐的DMEM孵育,C1、C2组细胞使用含有谷氨酸盐和GABA的DMEM孵育,将各组细胞置于细胞培养箱中培养24 h,应用乳酸脱氢酶试剂盒检测各组细胞的存活率.结果 重组真核表达载体构建正确,获得了稳定表达pIRES2-eGFP-Rho2的细胞株.A1、B1、C1组细胞存活率比较差异有统计学意义(F=5.542,P<0.05);其中B1、C1组细胞存活率显著低于A1组(P<0.05),C1组细胞存活率显著高于B1组(P<0.05).A2、B2、C2组细胞存活率比较差异有统计学意义(F=6.588,P<0.05);其中B2、C2组细胞存活率显著低于A2组(P<0.05),C2组细胞存活率显著高于B2组(P<0.01).A2组细胞存活率与A1组比较差异无统计学意义(P>0.05),B2组细胞存活率显著低于B1组(P<0.05),C2组细胞存活率显著低于C1组(P<0.05).结论 成功构建pIRES2-eGFP-Rho2真核表达载体,建立了稳定表达pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞株,为体外研究GABRR2的功能提供了实验基础,并证明使用GABA可缓解谷氨酸盐对细胞的损伤,为缺血性脑损伤的分子生物学治疗提供了靶点.
真核表达载体、γ-氨基丁酸、神经母细胞瘤、SH-SY5Y细胞、细胞克隆、基因表达
36
R739.4(肿瘤学)
河南省自然科学基金资助项目162300410218;河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目2015GGJS-132;国家大学生创新创业训练计划项目201610472045
2019-02-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共6页
13-18
