人源性Rab32荧光融合蛋白表达载体的构建及鉴定

摘要：

目的 构建人源性Rab32荧光融合蛋白表达载体pEGFP-Rab32,并观察Rab32在人黑素细胞瘤细胞系A375中细胞定位情况.方法 收集并提取A375细胞中的总RNA,反转录成cDNA,以特异性引物扩增Rab32片段,经XhoI和KpnI双酶切聚合酶链反应(PCR)产物和pEGFP-C3表达载体,酶切产物经胶回收、连接后转化至感受态大肠杆菌DH5a中,挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析,以确定表达载体构建正确.将构建的重组质粒转染A375细胞,Western blot检测细胞中Rab32表达水平,激光共聚焦显微镜观察其细胞定位.结果 pEGFP-Rab32重组质粒经菌落PCR、双酶切和测序鉴定构建正确,转染A375细胞后,Western blot可检测出细胞中pEGFP-Rab32融合蛋白的表达,激光共聚焦显微镜观察到Rab32定位于细胞质中,且大量聚集于细胞核周围.结论 pEGFP-Rab32融合蛋白表达载体成功构建,并观察了Rab32在细胞中的定位,为进一步研究Rab32在黑素代谢中的作用奠定了良好的基础.

关键词：Rab32、融合蛋白、表达载体、细胞定位、黑素代谢

所属期刊栏目：33

分类号：Q257(细胞生理学)

资助基金：国家自然科学基金资助项目编号:81371728,81472864.

在线出版日期：2016-09-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：745-747,751