小鼠尿激酶型纤溶酶原激活物与其受体结合关键氨基酸的鉴定

摘要：

目的 尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)在细胞表面介导多种生物学效应.本文目的是解析小鼠uPA蛋白结构中与其受体结合的关键氨基酸.方法 包含小鼠uPA全长cDNA的质粒购于ATCC公司,小鼠cDNA序列进一步克隆至Puro-pMT表达载体.用定点突变法构建各类uPA突变体表达质粒.表达质粒用磷酸钙转染至S2细胞中,用10μg/ml嘌呤霉素筛选稳定表达细胞.表达的重组蛋白分别用CM sephadex柱和sephadex G75柱纯化.纯化后的蛋白分别用SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定.用表面等离子共振技术(SPR)检测重组uPA与uPAR的结合常数.结果 用定点突变法成功构建小鼠uPA S22、Y23、K24、Y25、F26、S27、129、R31、Fal、S358分别突变为丙氨酸的突变体及R28、30、31突变为N28、14-30、W31的突变体M3.经阳离子交换层析和分子筛纯化,重组蛋白的纯度均大于95%并能被小鼠uPA抗体所识别.结合试验表明野生型uPA和M3型uPA的KD值分别为0.467 nM和1.64 nM,10种点突变uPA的KD值范围为0.388 nM至36.5 nM.结论 小鼠uPA中至少有7个氨基酸(Y23、K24、Y25、F26、S27、I29、R31)涉及小鼠uPA-uPAR的结合;Y23、Y25和F26是其中的关键氨基酸.

关键词：尿激酶型纤溶酶原激活物、受体、结合、小鼠

所属期刊栏目：16

分类号：Q517(蛋白质)

资助基金：教育部留学回国人员科研启动基金

在线出版日期：2011-05-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：259-263