先天性巨结肠血浆外泌体分子生物学及生物信息分析的初步研究

摘要：

目的:探究先天性巨结肠（Hirschsprung's disease，HD）血浆外泌体参与HD发生、发展的可能机制。方法:收集2020年4月至2021年7月嘉兴市妇幼保健院收治的14例男性患儿血液样本，将其中7例HD患儿作为实验组，年龄为（18.14±18.17）个月，范围为2~48个月；将年龄范围与实验组患儿相匹配的7例男性非HD患儿作为对照组，年龄为（27.14±13.81）个月，范围为6~48个月。收集14例患儿外周血各8 ml，采用超速离心法分离血浆后提取外泌体。经过透射电镜观察、样品粒径分析、蛋白指标检测和RNA浓度检测鉴定外泌体后，进行外泌体miRNA测序，最后对差异表达的miRNA及其靶基因采用GO富集分析和KEGG富集分析。结果:14例样本中均成功分离出外泌体，透射电镜下可观察到形态完整、球形、大小均一的典型外泌体结构。外泌体粒径分析结果显示，实验组与对照组血浆外泌体粒径分别为（144.22±33.98 ）nm和（122.99±21.24）nm，两组间的差异无统计学意义（
P=0.186）。血浆外泌体浓度分析结果显示，对照组与实验组血浆外泌体浓度分别为（3.39± 3.90）×10
9和（3.47±4.04）×10
10 Particles/ml，两组间的差异具有统计学意义（
P=0.002）。外泌体蛋白指标检测结果显示：①对照组与实验组的外泌体蛋白浓度分别为（0.42±0.17）μg/μl和（0.13± 0.12）μg/μl，对照组浓度显著高于实验组，差异具有统计学意义（
P=0.004）；②对照组和实验组的外泌体特异性阳性标志物CD9和CD81均有不同程度的表达，阴性标志物IgG基本没有表达。外泌体miRNA测序结果显示：①实验组RNA浓度高于对照组，（0.66±0.54 ）ng/μl比（0.24±0.10 ）ng/μl，两组间的差异具有统计学意义（
P＝0.011）；②共筛选出3个差异性表达的miRNA，包括miR-382上调，miR-29B2和miR-29A下调。运用KEGG分析差异表达的miRNA结果显示，miR-382主要富集于PI3K-Akt信号通路，miR-29A富集于癌症中的蛋白聚糖和Hippo信号通路，而miR-29B2则富集于细胞周期通路。分析miR-382、miR-29B2和miR-29a的靶基因，取完交集后分别得到73、782和770个靶基因。
结论:HD患儿血浆外泌体中差异性表达的miRNA及其靶基因参与肠神经节细胞的生物学功能、细胞周期等调节，可能与HD的发生、发展机制相关。

关键词：Hirschsprung病、外泌体、微RNA、靶基因

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资助基金：上海市卫生健康委员会卫生行业临床研究专项计划201940508;上海交通大学医学院儿科学院2021年儿科学专业"5+3"科研能力提升计划DKY20210002;浙江省医药卫生科技计划项目2022KY390, 2022RC271;Special Clinical Research Grant in Health Industry of Shanghai Municipal Health Commission201940508;2021 " 5+3" Scientific Research Capacity Improvement Plan for Pediatric College, Shanghai Jiao Tong University School of MedicineDKY20210002;Zhejiang Provincial Medical & Health Science & Technology Program2022KY390, 2022RC271

在线出版日期：2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：651-656