人β-防御素-3通过调控肠上皮细胞自噬对新生大鼠坏死性小肠结肠炎发挥保护作用的实验研究

摘要：

目的:研究人β-防御素-3(human beta-defensin-3，hBD3)对肠上皮细胞自噬的调节作用及其介导的自噬调控对肠上皮细胞迁移的影响。方法:应用雷帕霉素(Rapamycin)诱导肠上皮细胞IEC-6构建细胞自噬模型。根据实验设计分为对照(Control)组、雷帕霉素(Rapamycin)组和人β-防御素-3(hBD3)+雷帕霉素组。蛋白质印迹法检测各组肠上皮细胞自噬相关蛋白表达水平，mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒感染肠上皮细胞动态监测自噬流。应用CXCR4抑制剂和siRNA进一步验证hBD3调控自噬的潜在机制。划痕实验检测肠上皮细胞迁移能力，通过ATG7 siRNA转染的肠上皮细胞进一步佐证hBD3是通过调控自噬从而影响肠上皮细胞迁移。采用随机数字表法，将新生大鼠随机分为对照组+生理盐水(Control+NS，n＝11)，坏死性小肠结肠炎造模组+生理盐水(NEC+NS，n＝12)和坏死性小肠结肠炎造模组+hBD3(NEC+hBD3，n＝8)。通过配方奶喂养+缺氧冷刺激诱导构建坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)模型鼠，收集肠管组织检测自噬相关基因表达。结果:蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白结果显示，雷帕霉素组中应用200 nmol/L雷帕霉素处理IEC-6细胞24 h后，自噬相关蛋白p62、Beclin1和LC3 Ⅱ/Ⅰ相较于对照组的表达量分别为0.44±0.05、1.17±0.05和1.32±0.05，均较对照组差异有统计学意义(
P<0.001，
P＝0.026和0.001 4)，成功构建了肠上皮细胞自噬模型。hBD3+雷帕霉素组IEC-6细胞中p62、Beclin1和LC3 Ⅱ/Ⅰ相较于对照组的表达量分别为0.86±0.04、0.75±0.04和0.95±0.03，与雷帕霉素组比较，差异亦有统计学意义(
P＝0.009、0.002 7和0.003)，提示hBD3预处理可以显著抑制肠上皮细胞自噬水平。雷帕霉素组mRFP
+GFP
+斑点和mRFP
+GFP
-斑点计数分别为(38.33±2.02)个和(72.33±2.61)个，较对照组(3.67±0.88)个和(4.67±1.20)个明显增加，组间比较，差异有统计学意义(
P均<0.000 1)；hBD3+雷帕霉素组mRFP
+GFP
+斑点和mRFP
+GFP
-斑点数分别为(14.67±1.76)个和(16.00±2.41)个，均较雷帕霉素组明显减少，组间差异有统计学意义(
P均<0.000 1)，提示hBD3对IEC-6细胞自噬流有抑制作用。AMD3100+hBD3+雷帕霉素组IEC-6细胞中p62、Beclin1和LC3 Ⅱ/Ⅰ相较于对照组的表达量分别为0.22±0.04、0.91±0.02和1.16±0.02，与hBD3+雷帕霉素组比较，差异有统计学意义(
P＝0.000 4、0.022 3和0.005)，而CXCR4 siRNA+hBD3+雷帕霉素组IEC-6细胞中p62、Beclin1和LC3 Ⅱ/Ⅰ相较于对照组的表达量分别为0.39±0.03、1.02±0.04和1.13±0.02，与hBD3+雷帕霉素组相比，差异有统计学意义(
P＝0.000 8、0.009 6和0.011)，提示阻断或沉默CXCR4可有效逆转hBD3对自噬的抑制作用。雷帕霉素组肠上皮细胞迁移速率为0.58±0.04，hBD3+雷帕霉素组肠上皮细胞迁移速率为0.86±0.03，两项比较，差异有统计学意义(
P＝0.006 3)。转染ATG7 siRNA后，雷帕霉素组和hBD3+雷帕霉素组的肠上皮细胞迁移速率分别为0.95±0.04和0.99±0.02，组间比较，差异无统计学意义(
P＝0.089)。NEC+NS组中自噬相关基因Beclin1和LC3的表达量分别为2.01±0.06和2.49±0.09，较Control+NS组(0.96±0.04和1.01±0.02)和NEC+hBD3组(0.78±0.07和1.06±0.08)显著增加，组间差异有(0.78±0.07、1.06±0.08，
P均<0.001)。
结论:新生大鼠坏死性小肠结肠炎模型的肠管组织中自噬相关基因过度激活，hBD3通过与CXCR4结合能明显抑制肠上皮细胞自噬且hBD3介导的自噬抑制是其促进肠上皮细胞迁移的可能机制之一，从而对新生大鼠坏死性小肠结肠炎发挥保护作用。

关键词：小肠结肠炎，坏死性、防御素、受体、自噬

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资助基金：国家自然科学基金81601322、81871194;National Nature Science Foundation of China81601322 & 81871194

在线出版日期：2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：445-453