人磷酸甘油酸变位酶1在大肠杆菌中的表达及纯化

摘要：

目的 表达与纯化人磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1),为后续研究奠定基础.方法 用SnapGene设计5'侧翼添加Nde Ⅰ和Xho Ⅰ位点的上、下游引物,PCR扩增cDNA,扩增产物与质粒pET-28a经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化.用DNA ligase连接cDNA和pET-28a,热激法将连接产物转化大肠杆菌DH5α,转化产物涂布于含卡那霉素(Kanamycin)的LB平板(LBK板),筛选抗性菌落.于含卡那霉素的LB培养基(LBK培养基)培养抗性菌落,抽提质粒,进行酶切和测序鉴定.将重组质粒同法转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选抗性菌落.将一个抗性菌落接种于LBK培养基,37℃250r/min培养至OD600约0.8.用0.1mmol/LIPTG,16℃诱导PGAM1表达20h.收集细胞,超声破碎,离心取上清,用Ni2+-NTA试剂盒纯化PGAM1.超滤浓缩纯化的PGAM1,并用不含咪唑的缓冲液进行交换,降低PGAM1溶液中的咪唑浓度.BCA法测定PGAM1浓度,保存PGAM.结果 重组质粒pET-28a-PGAM1构建成功,基因工程菌pET-28a-PGAM1-BL21(DE3)经IPTG诱导,PGAM1获得可溶性表达,产量达120mg/L.结论 高纯度、高产的PGAM1为后续研究奠定了坚实基础.

关键词：磷酸甘油酸变位酶1、鉴定、表达、纯化、超滤

所属期刊栏目：36

分类号：Q558.4(酶)

资助基金：湖北科技学院博士启动项目;湖北科技学院糖尿病专项开放课题

在线出版日期：2022-09-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：292-295