人醛缩酶A在大肠杆菌中的表达及纯化

摘要：

目的 用基因工程生产人醛缩酶A(ALDOA),为后续酶学研究奠定基础.方法 用Snapgene设计一对5'分别附加Nde Ⅰ和Xho Ⅰ位点的引物,PCR扩增ALDOA cDNA,cDNA与质粒pET-28a经Nde Ⅰ+Xho Ⅰ酶切后用琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化.用DNA连接酶连接cDNA和pET-28a,连接产物转化大肠杆菌Top10,于卡那霉素的LB平板(LBK板)筛选抗性菌落.于LBK培养基培养抗性菌落,抽提质粒,酶切和测序鉴定.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),同法筛选抗性菌落,于LBK培养基培养抗性菌落,0.2mmol/LIPTG,16℃诱导24h.超声破碎细胞,离心取上清,用Ni2+-NTA试剂盒纯化ALDOA.超滤浓缩纯化的ALDOA,用pH7.0磷酸缓冲液交换洗脱液,降低ALDOA溶液中的咪唑浓度.BCA法测定重组ALDOA浓度并保存.结果 大肠杆菌表达质粒pET-28a-ALDOA构建成功,重组菌pET-28a-ALDOA-BL21(DE3)经0.2mmol/LIPTG诱导后,ALDOA获得可溶性表达,产量达600mg/L.结论 高产量、高纯度的ALDOA为后续酶学研究奠定了坚实基础.

关键词：醛缩酶A、表达、纯化、大肠杆菌、基因工程

所属期刊栏目：36

分类号：Q557.1(酶)

资助基金：湖北科技学院博士启动项目;湖北科技学院糖尿病专项开放课题

在线出版日期：2022-07-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：216-219