基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法

摘要：

[目的]基于TaqMan-MGB探针建立虾肝肠胞虫(EHP)荧光定量PCR检测方法,为EHP的快速定量检测及实时监测提供技术手段.[方法]以EHP的SSU rDNA基因为检测靶基因,在其保守区设计特异性的扩增引物和TaqMan-MGB探针,将PCR扩增目标片段克隆至pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-T-SSUEHP(标准品),以标准品DNA为模板优化反应体系,建立检测EHP的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR;以10倍梯度稀释的标准品DNA为模板构建扩增标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验.[结果]制备的重组质粒pMD18-T-SSUEHP DNA稳定性好,可满足作为标准品和阳性对照的要求;标准品(pMD18-T-SSUEHP)起始模板范围为2.0×101～2.0×109拷贝/反应时,建立的标准曲线线性关系良好,对应的线性回归方程为y=-3.232×lg(x) +39.51.基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR对标准品的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对临床虾样品EHP的检测灵敏度约10拷贝/mg,较农业农村部推荐的套式PCR约提高10倍;对虾类其他常见病原均无扩增反应,其组内和组间变异系数分别为0.26％～0.72％和0.56％～0.92％,整个检测过程可在1h内完成.采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与套式PCR同时对276份临床虾样品进行检测比较,发现两种方法的符合率为96.7％,检测低拷贝数虾样品时前者具有更高的灵敏度;2018和2019年广西虾样品的EHP阳性检出率分别为16.2％和30.6％.[结论]基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品的EHP定量检测,可为EHP实时监测及EHPD快速诊断提供一种新的技术手段.

关键词：虾肝肠胞虫、SSU rDNA基因、TaqMan-MGB探针、荧光定量PCR

所属期刊栏目：33

分类号：S945.4(水产保护学)

资助基金：广西创新驱动发展专项;广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室自主研究项目

在线出版日期：2020-08-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：1319-1326