慢病毒载体介导稳定表达Cpf1的细胞系的构建及其基因编辑效率验证

摘要：

[目的]通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑.[方法]PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达LbCpf1和AsCpf1的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证.用设计好的针对ABCG1基因的sgRNA转染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率.[结果]成功构建了Cpf1-pLent慢病毒载体,重组载体对293FT细胞进行慢病毒包装、浓缩与纯化后,病毒滴度均在106 TU/mL之上.用纯化后的病毒感染293 T和HT 1080细胞,筛选出3株能稳定表Cpf1的细胞系,目的ABCG1基因的基因编辑功能验证表明其中2株T7EI酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,命名为AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT1080 02-3B.[结论]建立了稳定表达Cpf1的293T和HT 1080细胞细胞系,可以用于目的基因的高效敲除.

关键词：CRISPR/Cpf1、慢病毒载体、细胞系、基因编辑

所属期刊栏目：33

分类号：S154.32(土壤学)

资助基金：江苏省高等学校自然科学研究面上项目;江苏省高职院校教师专业带头人高端研究项目;江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目

在线出版日期：2020-05-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：246-251