滇龙胆香叶醇10-羟化酶基因的克隆与表达分析

摘要：

[目的]克隆滇龙胆香叶醇10-羟化酶基因GrG10H(geraniol 10-hydroxylase),分析其生物信息学特征、基因结构、蛋白表达和组织表达情况,为龙胆苦苷生物合成途径解析提供理论依据.[方法]通过RT-PCR及基因克隆方法,从滇龙胆总RNA中克隆得到基因GrG10H及其基因组序列;使用生物信息学方法分析其DNA序列及其编码蛋白特性,使用Clustal X2.1软件对GrG10H蛋白质及其同源序列做序列比对,使用MEGA7.0软件进行系统发育树构建;利用定量PCR技术分析GrG10H基因在滇龙胆根茎叶中的表达水平.[结果]使用RT-PCR方法从滇龙胆叶片中克隆得GrG10H基因全长为1834 bp,包含2外显子和1内含子,ORF1548 bp,将序列提交至GenBank,得到序列号KJ418410.生物信息学分析表明,该基因编码515个氨基酸,分子量为57.74 kD,理论等电点为9.02;该蛋白属于细胞色素P450超家族成员,定位于内质网,其N端含一跨膜螺旋(21 ～43),其中1～20氨基酸残基位于膜内,44～515位于膜外.该蛋白无信号肽,为亲水稳定蛋白,主要由无规则卷曲(44.85％)和α-螺旋(40.58％)构成.GrG10H蛋白与川西獐牙菜SmG10H蛋白具有较高的相似性(87％),且亲缘关系最近.原核表达结果表明,GrG10H基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为83.74 kD(含GST标签26.00 kD),与预期蛋白大小一致.组织特异性表达分析结果表明GrG10H基因主要在叶中表达.[结论]克隆到滇龙胆GrG10H基因,并成功在大肠杆菌中表达,推测其在主要叶片中起作用.

关键词：滇龙胆、香叶醇10-羟化酶、基因克隆、表达分析

所属期刊栏目：30

分类号：Q786(基因工程（遗传工程）)

资助基金：云南省教育厅重点项目2015Z171;云南省大学生创新项目201511390005

在线出版日期：2017-09-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：1499-1506