七种猪常见病毒核酸磁-纳米微粒可视化快速检测技术的建立与应用

摘要：

随着集约化养殖业的发展,规模化养猪场对于病原的早期快速检测需求逐步增高,本研究旨在建立针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒 2 型(porcine circovirus type 2,PCV2)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diar-rhea virus,PEDV)、猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastro-enteritis virus,TGEV)和猪细小病病毒(porcine parvovirus,PPV)等7种常见病毒病病原感染的广谱磁纳米微粒可视化(ultrasensitive nanoparticle visualization detection,UNVs)现场检测技术.根据不同病毒的复制酶区域的高度保守区域,设计探针和引物,通过探针的筛选和条件的优化,得到具有特异性强、富集效率和杂交效率高的目的病原基因序列特异性识别探针(富集探针和杂交探针),分别与四氧化三铁磁性微粒和纳米金偶联,制备成针对每种病原的特异性功能化磁珠和功能化纳米金.以功能化磁珠为载体富集核酸信号,功能化纳米金做桥梁放大信号,使用双探针同时检测病原核酸,结合碱性磷酸酶的酶促可视化反应检测信号,建立针对猪PCV2、PRV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV等7种病毒的现场可视化UNVS便捷诊断技术.结果 显示,筛选设计的核酸探针与猪的其它病原无交叉反应,特异性良好.建立的针对PCV2、PRV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV病原的UNVs可视化检测技术,检测限为103 copies·mL-1(血清样本)或103 copies·g-1(粪便样本),基本上达到了 PCR或RT-PCR的检测敏感度,灵敏度组内与组间最大变异系数均小于5％,显色结果稳定,无较大差异,有良好的重复性,单个样本的检测可在4 h以内完成.应用该技术和PCR检测对来自陕西省的499份临床样品(疑患有PCV2、PRV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV的猪的血清、粪便样品)进行同步检测和复检,结果显示,建立的针对7种病原的UNVs可视化检测方法不仅具有与普通PCR相同的敏感度,甚至与普通PCR相比有更高的检出率.本研究成功建立了针对PCV2、PRV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV病原的UNVs可视化检测技术,具有灵敏度较高、检测范围广以及特异性和可靠性良好的优点,为猪的多种病原提供了一种快速、准确、灵敏的诊断技术.

关键词：猪病毒病、磁纳米微粒、碱性磷酸酶、可视化、现场检测

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分类号：S858.285.3(动物医学（兽医学）)

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金;陕西省农业专项资金资助项目;陕西省创新能力支撑计划项目;陕西省重点研发计划;陕西省重点研发计划;西安市科技计划项目

在线出版日期：2023-10-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共15页

页码：3848-3862