PhiC31整合酶电穿孔鸡成纤维细胞诱发位点特异性基因盒交换

摘要：

旨在验证直接电穿孔重组蛋白PhiC31能否在鸡DF-1细胞中诱导PhiC31介导的基因盒交换.本研究通过原核表达和经亲和层析纯化获得SUMO-His-PhiC31融合蛋白,利用SUMO酶切除SUMO-His标签,获得天然的PhiC31蛋白.这两种蛋白先与pBCPB+质粒在试管内共孵育进行分子重组反应.之后,先将带有attPTT-DsRed2-attPCT片段的"着陆点"(landing pad,LP)质粒通过电穿孔导入DF-1细胞,然后进行第二次电穿孔,将带有attBTT-EGFP-HiBiT-attBCT的donor质粒连同PhiC31蛋白导入上述DF-1细胞,验证DsRed2-EGFP基因盒交换事件发生.结果显示,成功构建了原核表达载体pET-28a-SUMO-PhiC31,经IPTG诱导,该重组质粒在大肠杆菌中以可溶性方式表达SUMO-His-PhiC31融合蛋白,经亲和层析纯化,SUMO-His-PhiC31蛋白的产量达12 mg·L-1;该融合蛋白和切除SUMO-His标签的天然PhiC31蛋白均成功触发了 pBCPB+质粒attP和attB位点之间的重组反应,重组效率基本一致(50％vs.52％);以脂质体转染法将PhiC31真核表达质粒pCMVInt与LP质粒和donor质粒共转染DF-1细胞,荧光显微镜观察证实了 DsRed2-EGFP置换现象;以电穿孔方式将LP质粒、donor质粒和PhiC31蛋白先后导入DF-1细胞,获得了相同结果,表明PhiC31蛋白引发了 attPTT 与attBTT、attPCT与attBCT 之间的重组反应.通过原核表达获得的PhiC31蛋白具有生物活性,有望成为一种重要试剂而用于Easi-CRISPR-TAR-GATT介导的转基因鸡研究.

关键词：PhiC31整合酶、原核表达、电穿孔、RMCE、DF-1细胞、鸡

所属期刊栏目：54

分类号：S831.2(家禽)

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金;广西自然科学基金重点项目;广西科技计划重点研发项目

在线出版日期：2023-07-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共13页

页码：2330-2342