副猪格拉瑟菌5型细胞致死性膨胀毒素CdtB破坏猪呼吸道上皮屏障的机制

摘要：

旨在探究副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis,GPS)突破猪呼吸道上皮屏障引起系统性感染的机制.通过超速离心和密度梯度离心提取副猪格拉瑟菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs),OMVs经SDS-PAGE显示,蛋白质条带分布在55～100 ku,经透射电子显微镜(TEM)观察,OMVs的粒径在100～200 nm,纳米粒子直径分析(NTA)结果显示,样品在100～200 nm处的粒子数目最多.进而用制备的HbpA及OmpP2多克隆抗体对OMVs及不含OMVs的细菌上清进行Western blot验证,证实所提取的样品为外膜囊泡,且进一步结果证明细胞致死性膨胀毒素(CDT)在GPS培养物中主要以OMVs的形式存在.用OMVs或CdtB处理猪气管上皮细胞(swine tracheal epithelial cells,STEC)36 h,检测 STEC 中 cleaved-caspase3、ZO-1 和 Occludin 的蛋白表达水平,并用FITC-葡聚糖(FD-4)检测STEC单层细胞的细胞旁通透性.结果发现,OMVs与CdtB处理后凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达水平升高,ZO-1和Occludin的表达水平降低,FD-4渗透率升高,同时,乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试验发现,当CdtB与STEC单层细胞共孵育24 h、OMVs与STEC单层细胞共孵育36 h后,STEC存活率显著降低.而Pifithrin-α预处理STEC可抑制OMVs和CdtB引起的细胞凋亡和屏障通透性的增加.另外,用免疫磁珠捕获的方法去除 OMVs 中的 CdtB(OMVs-△CdtB),OMVs-4CdtB 处理 STEC 36 h 后 cleaved-caspase3、ZO-1、Occludin表达水平与对照组相比无显著差异.综上,成功提取并纯化GPS OMVs,且试验证明GPS可通过OMVs转运CdtB诱导STEC凋亡和屏障损伤,为副猪格拉瑟菌突破呼吸道上皮屏障的机制提供新思路.

关键词：副猪格拉瑟菌、外膜囊泡、细胞致死性膨胀毒素CdtB、猪呼吸道上皮细胞

所属期刊栏目：54

分类号：S852.61(动物医学（兽医学）)

资助基金：国家重点研发计划;国家自然科学基金;江苏高校优势学科建设工程专项资金项目

在线出版日期：2023-03-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共13页

页码：304-316